白藜蘆醇通過影響細胞外信號調節蛋白激酶信號通路對創傷性腦損傷后的神經保護作用

巴方，陳學云，劉洪亮

（中國醫科大學附屬盛京醫院康復科，沈陽 110134）

創傷性腦損傷是一種比較常見的神經損傷，其致死、致殘率較高，給患者、家庭和社會造成極大的痛苦和經濟負擔。嚴重的腦損傷不僅可以引起直接和即時的神經元損傷，還可能導致長期和逐漸演變的后遺癥，如神經膠質細胞過度活化和某些信號分子通路的活化，最終阻礙神經功能的恢復［1］。近年來發現，白藜蘆醇具有腦保護作用，但其具體作用機制尚不清晰。本課題組前期研究［2］結果顯示，白藜蘆醇對小鼠創傷性腦損傷后的神經保護作用與改善損傷導致的星形膠質細胞活化表達有關。細胞外信號調節蛋白激酶 （extracellular signal-regulated kinase，ERK） 是絲裂原活化蛋白激酶 （mitogenactivated protein kinase，MAPK） 信號通路家族中的重要成員之一。中樞神經損傷時，MAPK家族信號通路被激活，表達上調。研究［3］發現，ERK信號通路作為MAPK家族的重要成員之一，在損傷后迅速發生活化，而且這種活化可以持續一段時間，抑制ERK信號通路的持續活化，可以使損傷結果發生決定性改變。并且研究［4］顯示，腦損傷后ERK信號通路的活化表達參與星形膠質細胞的增殖活化過程，但白藜蘆醇對腦損傷后ERK信號通路在星形膠質細胞中活化表達的影響，即白藜蘆醇對腦損傷后的神經保護作用機制是否與ERK信號通路在星形膠質細胞中的活化有關，尚不清楚。本研究通過建立小鼠創傷性腦損傷模型，給予白藜蘆醇治療后，觀察其對腦損傷的神經保護作用，并進一步檢測白藜蘆醇對ERK信號通路在星形膠質細胞中活化表達的影響，探討其神經保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取96只8周齡雄性昆明小鼠，SPF級，體質量25～30 g，購于中國醫科大學實驗動物中心，使用許可證號SYXK （遼） 2013-0007。將小鼠隨機分為假手術組 （n=16）、DMSO組 （n=40） 和白藜蘆醇預處理組 （n=40）。

1.2 創傷性腦損傷模型的建立

小鼠黑質紋狀體通路損傷模型的制備參考KAWANO等［5］的方法。簡述之，經10%水合氯醛 （30 mg/kg） 腹腔注射麻醉后，將小鼠固定于腦立體定位儀上。消毒，頭皮切開，暴露顱骨，去除表面的硬腦膜，在前囟點右后方1.5 mm、右側顱骨中線外側0.5 mm處，用骨鉆在顱骨鉆一適合刀口大小的缺口，暴露大腦。將已固定好的寬度約2.0 mm的切刀調整至大腦表面位置，緩慢進刀至距離大腦表面深度為5.5 mm，停留大約3～5 s，緩慢拔出刀片，止血縫合。假手術組僅暴露顱骨。

1.3 給藥處理及取材

假手術組不做任何給藥處理。將白藜蘆醇溶解于DMSO中，并用0.1 mmol/L的PBS稀釋，最終制備濃度為0.3 μg/μL （其中DMSO濃度<1%），白藜蘆醇預處理組損傷前1 d側腦室給藥3 μL。DMSO組在損傷前1 d側腦室給予相同劑量含PBS的DMSO溶液。

損傷后4 d進行取材。10%水合氯醛腹腔麻醉（30 mg/kg），固定四肢，消毒后打開腹腔，剪破膈肌，暴露心臟，經左心室插管，先以常溫的含有肝素的生理鹽水將血液沖洗干凈，然后用4%冰冷的多聚甲醛進行灌注。待固定后斷頭取腦組織，經冰冷的4%多聚甲醛后固定后，用30%蔗糖溶液預處理。用冰凍切片機在-25 ℃條件下制成10 μm厚水平位腦組織切片，以備FJC染色使用。部分動物在生理鹽水灌注后不經多聚甲醛固定，直接取新鮮腦組織-80℃保存，以備Western blotting檢測。

1.4 FJC染色

FJC染色是近年來新興的一種神經元染色方法，這種染料對損傷變性的神經元有很高的親和力，標記后可以對損傷神經元進行定性定量分析。簡述之，取-20 ℃保存的冰凍切片室溫復溫15～30 min左右，浸泡在蒸餾水中2 min，轉浸入含1% NaOH的80%乙醇中5 min，然后在70%乙醇中浸洗2 min，經蒸餾水浸洗2 min后在0.06%高錳酸鉀中反應10 min；蒸餾水浸洗2 min；用0.1%乙酸配制0.000 1%Fluoro-Jade C工作液，現配現用，反應20 min；蒸餾水浸洗3 min；將切片烘干，二甲苯透明后，用PBS或者抗熒光淬滅劑進行封片。熒光顯微鏡下觀察并拍照保存。

FJC染色用于檢測紋狀體神經元細胞的凋亡情況。在10個不重疊切片中，在920 μm×860 μm的面積內計數FJC陽性細胞總數，FJC陽性細胞數 （μm-2） =FJC陽性細胞總數/面積。

1.5 免疫組織化學熒光染色

組織切片取出后室溫復溫15～30 min，0.01 mol/L PBS漂洗3次，每次5 min。0.2% Triton進行透膜處理10 min，PBS漂洗，5%牛血清白蛋白在37 ℃下封閉30 min，加入GFAP抗體 （1∶500） 和p-ERK抗體 （1∶100）4 ℃孵育過夜。第2天取出室溫復溫30 min，PBS漂洗3次，每次5 min。配制熒光二抗cy3溶液 （1∶200），避光37 ℃恒溫條件下孵育1 h，PBS漂洗3次，每次10 min，注意避光。抗熒光淬滅劑封片并晾干后，熒光顯微鏡下觀察拍照。GFAP陽性細胞表達紅色熒光，所得圖片應用Photoshop軟件進行處理。

免疫組織化學熒光染色用于檢測ERK信號通路在星形膠質細胞中的活化表達情況。在10個不重疊切片中，在920 μm×860 μm的面積內計數p-ERK和GFAP共表達陽性細胞總數，p-ERK和GFAP共表達陽性細胞數 （μm-2） =p-ERK和GFAP共表達陽性細胞總數/面積。

1.6 統計學分析

數據用EM表示，所有實驗重復進行3次，每組動物數量≥3。應用GraphPad Prism5軟件對數據進行統計分析，多組間比較采用單因素或多因素方差分析，2組間比較采用Bonferroni檢驗。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對腦損傷后紋狀體神經元凋亡的影響

為了探究白藜蘆醇對腦損傷后紋狀體神經元的影響，對黑質紋狀體通路損傷后4 d的小鼠大腦做水平位切片，進行FJC染色。對一定面積的FJC陽性細胞 （圖片中的綠色熒光信號） 進行計數。結果顯示，假手術組FJC染色幾乎沒有陽性細胞表達 （圖片未顯示）；損傷后，DMSO組和白藜蘆醇預處理組FJC陽性細胞數分別為 （39.2±6.9） 和 （26.4±5.0） /μm2，與DMSO組相比，白藜蘆醇預處理組FJC陽性細胞數明顯減少 （P=0.006）。見圖1。

圖1 腦損傷后DMSO組和白藜蘆醇預處理組紋狀體神經元的凋亡 ×20Fig.1 Striatal neuronal apoptosis in DMSO and resveratrol pretreatment groups after brain injury ×20

2.2 白藜蘆醇對腦損傷后ERK信號通路活化的影響

為了進一步探究白藜蘆醇對腦損傷后神經保護的作用機制，檢測腦損傷后白藜蘆醇對ERK信號通路在星形膠質細胞中活化表達的影響。結果顯示，假手術組p-ERK染色幾乎沒有陽性細胞表達 （圖片未顯示）；腦損傷后p-ERK可定位表達在星形膠質細胞中，DMSO組和白藜蘆醇預處理組p-ERK和GFAP （星形膠質細胞標志蛋白） 共表達陽性細胞數分別為 （27.4±6.2） 和 （16.5±4.9） /μm2，與DMSO組相比，白藜蘆醇預處理組中p-ERK和GFAP共表達陽性細胞數明顯減少 （P< 0.01），見圖2。其中p-ERK陽性細胞為綠色熒光信號，GFAP陽性細胞為紅色熒光信號，DAPI染色為藍色熒光信號。

3 討論

圖2 腦損傷周圍p-ERK和GFAP的免疫熒光染色 ×20Fig.2 Immunofluorescence staining for p-ERK and GFAP around the lesion site ×20

創傷性腦損傷后數小時可以觀察到巨噬細胞、小膠質細胞遷移到損傷區，產生大量毒性細胞因子和氧自由基，導致繼發的興奮性毒性腦損傷。隨著研究的不斷深入，人們發現中樞神經損傷后比周圍神經難以修復，原因之一是中樞神經有不利于神經再生的微環境，尤其是膠質細胞在阻礙神經損傷修復的過程中扮演了重要角色［6-7］。因此，損傷后膠質細胞的變化與中樞神經可塑性之間的關系尤為重要。本課題組前期研究［8］發現，損傷后星形膠質細胞發生增殖活化，并在周圍形成膠質界膜，從而阻礙了損傷后神經軸突的修復和再生。星形膠質細胞形成的膠質瘢痕被認為是中樞神經系統損傷后阻礙神經元再生的物理屏障，星形膠質細胞過度增殖活化產生多種促炎性細胞因子，如白細胞介素-1β、白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α，這些炎性細胞因子的過量表達通過正反饋作用進一步加劇了膠質細胞的活化，并加重神經元損傷，抑制其修復和再生［9-10］。

研究［11］發現，腦損傷后MAPK家族的主要成員ERK發生活化并高表達，而抑制ERK信號通路的高表達可以改善腦損傷造成的神經損傷。雖然已經證實了ERK信號通路的活化參與各種體外和體內損傷的模型，但其活化在星形膠質細胞活化中的作用尚無明確的定位。本課題組前期研究［4］結果證實，腦損傷后ERK信號通路參與星形膠質細胞和小膠質細胞的增殖活化表達，且抑制ERK信號通路在2種膠質細胞中的活化，可以改善星形膠質細胞和小膠質細胞的增殖活化表達，并對損傷后神經功能恢復具有一定的促進作用。

雖然已有文獻報道了在體外細胞培養實驗中白藜蘆醇的神經保護作用與ERK信號通路活化有關，但在體內兩者的相互關聯及作用鮮有報道［12］。本研究應用白藜蘆醇預處理，可以減少FJC染色陽性細胞數，從而達到抑制紋狀體神經元凋亡的效果；檢測腦損傷后ERK信號通路在星形膠質細胞中的活化表達，為進一步探究白藜蘆醇在腦損傷中的神經保護作用機制提供了理論依據。但白藜蘆醇通過何種途徑影響ERK信號通路的活化表達，有待進一步的研究。