斑蝥素阻斷核轉錄因子κB信號通路抑制血管平滑肌細胞增殖和遷移

邱立強，夏豪，江洪，李雯靜，吳剛，羅強，徐昌武

眾所周知，動脈粥樣硬化是包括心肌梗死和腦卒中在內的多種心腦血管疾病的病理基礎，而血管平滑肌細胞（VSMCs）的增殖和遷移在動脈粥樣硬化和血管再狹窄中起關鍵作用[1]。包括經皮腔內血管成形術、支架置入術等在內的介入治療手段仍然是治療心腦血管疾病的主要選擇[2]。然而，因VSMCs遷移至內膜并過度增殖而導致的血管再狹窄時常發生，并最終導致手術失敗[3]。研究表明核轉錄因子κB（NF-κB）介導的炎癥反應在血管內再狹窄的發生和發展中起關鍵作用[4-5]。斑蝥素是我國傳統中藥斑蝥的主要活性成分，其對包括肺癌[6]、乳腺癌[7]以及黑色素瘤[8]等多種癌細胞的增殖和侵襲有顯著的抑制作用，其中黑色素瘤細胞發揮作用與抑制NF-κB信號通路活性有關。但斑蝥素在心腦血管疾病，尤其是與VSMCs功能密切相關的動脈粥樣硬化及血管再狹窄中是否也具有類似作用，一直以來卻鮮有報道。為此我們通過脂多糖誘導VSMCs增殖和遷移，觀察了斑蝥素對大鼠胸主動脈VSMCs增殖和遷移的作用以及對NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雄性大鼠（120～180 g），購自湖北省實驗動物研究中心；脂多糖、二甲基亞砜（DMSO）和斑蝥素購自美國Sigma公司；DMEM/F12培養基、1×磷酸鹽緩沖液（PBS，137 mmol/L氯化鈉、2.7 nmol/L氯化鉀和10 mmol/L 的 PBS，PH：7.3～7.5）購自美國HyClone公司；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司；雙抗購自杭州吉諾公司；細胞毒性及增殖檢測試劑盒（CCK-8）購自日本株式會社同仁化學研究所；碘化丙啶（PI）購買于上海生工；酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自美國 ImmunoWay Biotechnology公司；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、BCA法蛋白濃度測定試劑盒、VSMCs表型標志蛋白（α-SM-actin）抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購自碧云天生物技術研究所；NF-κB p65（p65）、磷酸化NF-κB p65（P-p65）、NF-κB 抑制蛋白（IκB-α）抗體均購自美國CST公司；熒光二抗購自美國LICOR 公司；Trizol購自南京AIDLAB公司；聚偏氟乙烯（PVDF）膜購自美國merck-millipore，脫脂奶粉購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 方法

大鼠胸主動脈VSMCs 的分離培養和鑒定：采用組織塊貼壁法培養原代大鼠胸主動脈VSMCs。原代培養用含15% FBS和1%雙抗的DMEM/F12培養基，2天換液1次。傳代后用含10% FBS的DMEM/F12培養基培養。用抗α-SM-actin抗體對VSMCs特異性的α-肌動蛋白進行免疫熒光染色鑒定，α-SM-actin陽性顯色率達到95%以上。第3～5代細胞用于實驗。

CCK-8檢測細胞活性和確定脂多糖使用濃度：如文獻[9]所述，具體步驟如下：（1）細胞活性檢測，將細胞以2.0×104個/孔的密度接種在96孔板中。待細胞融合至80%時，換無血清培養基饑餓處理24 h，再與不同劑量（0、1.25、2.50、5.00和10.00 μmol/L）的斑蝥素或0.1%的DMSO共孵育24 h，然后向每孔加入10 μl CCK-8試劑（使CCK-8試劑含量為10%）繼續培養2 h后，在酶標儀上（450 nm）測各孔的光密度（OD）值。（2）LPS使用濃度的確定，將細胞以2.0×104個/孔的密度接種在96孔板中。待細胞融合至60%時，換無血清培養基饑餓處理24 h，再與不同劑量（0、0.01、0.10、1.00、10.00和50.00 mg/L）的脂多糖共孵育24 h，然后向每孔加入10 μl CCK-8試劑（使CCK-8試劑含量為10%）繼續培養2 h后，在酶標儀上（450 nm） 測各孔的OD值。每組設6個復孔。

實驗分組：對照組、1 mg/L 脂多糖刺激組、脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組和脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組。

流式細胞儀檢測細胞增殖：如文獻[10]中所述，具體如下：將細胞接種于6 cm培養皿中，待細胞融合至60%左右時，饑餓處理24 h。后將各組培養基更換為含脂多糖和（或）相應濃度斑蝥素的1% FBS的培養基，繼續培養24 h。接著用胰酶將細胞消化下來并離心，用PBS洗滌2次后加入預冷的70%的乙醇固定細胞并4℃過夜。取出細胞離心并用PBS洗滌細胞2次，然后加入0.4 ml PI稀釋液（含50 mg/L的PI和100 mg/L的RNase A）室溫避光孵育30 min，然后使用流式細胞儀（Becton Dickinson， 美國）檢測各組細胞周期分布情況，并計算出各組細胞處于G1期，S期，G2期的比例。

Transwell實驗檢測各組細胞遷移[11]：用含有或不含有相應濃度斑蝥素的培養基將細胞密度調整為5.0×108個/L，然后每組每孔取200 μl種植于上室，下室加入600 μl含15% FBS的培養基，添加或不添加脂多糖，于培養箱中孵育12 h后取出；并將小室用PBS小心沖洗3次，并用棉簽將小室內面未穿過的細胞輕輕擦去；用4%的多聚甲醛室溫固定20 min后用PBS小心沖洗3次；然后將小室放入1 mg/L的DAPI中染色2 min，用PBS洗滌后在熒光顯微鏡（Olympus，日本）200倍下隨機選取6個視野并拍照，最后使用Image J 1.51w software（NIH， 美國）軟件計數穿過小室的細胞數。

蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達：蛋白抽提后，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定其蛋白濃度[12]，然后加入上樣緩沖液煮沸后備用。按每孔30 μg總蛋白于預先配置好的10%聚丙烯酰胺凝膠上電泳進行蛋白分離。然后電轉至預先活化好的PVDF膜上。電轉完成后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。PBST（1×PBS含0.1%的吐溫-20）洗滌3次后，分別與IκB-α、p65、P-p65、GAPDH一抗4℃孵育過夜。取出PVDF膜用PBST洗滌3次，再與熒光標記羊抗兔二抗室溫避光孵育1 h。取出PVDF膜，在避光環境下用PBST洗滌3次后使用Odyssey雙色近紅外激光成像系統（Li-Cor Biosciences， 美國）采集蛋白條帶圖像，測定灰度值通過校準GAPDH作為內參進行半定量分析。

實時熒光定量聚合酶鏈式反應法（q-PCR）檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的信使核糖核酸（mRNA）表達水平：采用Trizol提取細胞總核糖核酸（RNA）。用反轉錄試劑盒（AMV，Promega公司）進行互補脫氧核糖核酸（cDNA）合成和擴增。相關基因的引物序列見表1。q-PCR法檢測各基因mRNA表達。

表1 基因及引物序列

ELISA法測定培養液中TNF-α、IL-6濃度：各組細胞經脂多糖和（或）斑蝥素處理24 h后，收集各組細胞培養液后離心去除細胞碎片，按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀在450 nm 處測各組OD值。根據標準品的濃度和OD 值計算出標準曲線的回歸方程式，并計算出樣品中對應的濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品中TNF-α、IL-6實際濃度。

統計學方法：以SPSS 22.0統計軟件包進行統計學分析。結果以均數±標準差或率表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

大鼠胸主動脈VSMCs鑒定以及斑蝥素對VSMCs活性的影響：VSMCs特異性的α-肌動蛋白免疫熒光染色結果顯示，α-SM-actin陽性顯色率達到95%以上（圖1），符合實驗要求。CCK-8結果（圖2A）顯示，與DMSO比較，不同濃度（1.25、2.50、5.00和10.00 μmol/L）斑蝥素處理后的細胞活性差異均未見統計學意義（P均＞0.05）；斑蝥素濃度在10 μmol/L及以下時，不會對細胞活性產生影響，故以下實驗斑蝥素劑量均不超過10 μmol/L。圖2B顯示，當脂多糖使用濃度為1 mg/L時VSMCs增殖能力顯著提高，但隨著脂多糖濃度的進一步增加其增殖能力增速減慢，故在本實驗中選擇脂多糖的濃度為1 mg/L。

圖1 大鼠VSMCs免疫熒光染色鑒定(×400)

圖2 CCK-8分析斑蝥素對大鼠VSMCs活性的影響以及脂多糖對VSMCs增殖的影響

斑蝥素對脂多糖誘導的VSMCs增殖的影響：圖3顯示，與對照組比較， 1 mg/L 脂多糖刺激組S期（藍色斜線區域）細胞明顯減少，而G2期（黃色區域）細胞占比明顯增多（P均＜0.01）。然而，與1 mg/L 脂多糖刺激組比較，脂多糖刺激后加用10μmol/L斑蝥素組S期（藍色斜線區域）細胞顯著增多（P＜0.01），G2期（黃色區域）細胞占比明顯減少（P＜0.05）。

圖3 流式細胞儀分析斑蝥素對脂多糖誘導的大鼠VSMCs增殖的影響

斑蝥素對脂多糖誘導的VSMCs遷移的影響：圖4顯示，與對照組比較，1 mg/L 脂多糖刺激組穿出小室的細胞數增加46.3%（P＜0.01）；而脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組和脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組穿出小室的細胞數分別較1 mg/L脂多糖刺激組減少72.0%和90.4%（P＜0.01）；與脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組比較，脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組穿出小室的細胞數減少 65.9%（P＜0.01）。

Western blot結果（圖 5） 顯示：IκB-α 作為NF-κB通路激活的抑制蛋白，在1 mg/L 脂多糖刺激組其表達較對照組顯著降低（P＜0.01），而加入斑蝥素后其表達隨著斑蝥素濃度的增加而升高（P＜0.05）；與脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組比較，脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組IκB-α表達進一步升高50.8%（P＜0.05）。P-p65水平在脂多糖作用后表達較對照組明顯增加（P＜0.05）；而經斑蝥素處理后其表達呈濃度依賴性受到抑制（P均＜0.05）；而T-p65水平在脂多糖誘導以及經斑蝥素處理后其表達差異均未見統計學意義（P均＞0.05）。

圖4 Transwell分析斑蝥素對脂多糖誘導的大鼠VSMCs遷移的影響

圖5 Western blot分析斑蝥素對大鼠VSMCs的NF-κB 信號通路相關蛋白影響

q-PCR和ELISA結果顯示：q-PCR結果（圖6A～C）顯示，與對照組比較，1 mg/L 脂多糖刺激組細胞內TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平均顯著升高（P均＜0.05）；與1 mg/L 脂多糖刺激組比較，脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組和脂多糖刺激后加用10 μmol/L斑蝥素組TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平均明顯降低（P均＜0.05），另外與脂多糖刺激后加用5 μmol/L斑蝥素組比較，脂多糖刺激后加用10μmol/L斑蝥素組TNF-α、IL-6、MCP-1 mRNA水平較低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。ELISA結果（圖6D～E）顯示，與對照組比較，1 mg/L 脂多糖刺激組TNF-α、IL-6濃度均有明顯升高（P均＜0.01），而脂多糖引起的TNF-α、IL-6濃度升高在斑蝥素處理后其濃度隨著斑蝥素濃度的增加而降低（P均＜0.05）。

圖6 q-PCR和ELISA測定斑蝥素對大鼠VSMCs促炎因子TNF-α、IL-6、MCP-1表達的影響

3 討論

心腦血管疾病是全世界因疾病造成死亡的主要原因，嚴重威脅人類生命健康[13-14]。心腦血管疾病介入治療雖在很大程度上改善了患者的預后，但支架置入引起的內皮損傷可顯著促進白細胞、血小板和脂質顆粒等局部聚集導致炎癥反應[15-16]。隨之，白細胞、內皮細胞和VSMCs等產生促炎細胞因子，導致VSMCs增殖、遷移和細胞外基質形成并最終導致再狹窄[17]。因此抑制血管炎癥反應，在治療血管再狹窄中具有重要意義。

斑蝥素是我國傳統中藥斑蝥的有效提取成分，是一種選擇性蛋白磷酸酶2A（PP2A）抑制劑[18]。PP2A 是細胞內最重要的磷酸酶之一，參與調控包括細胞增殖和轉錄等在內的多種重要的生理過程[19]。目前關于斑蝥素的研究主要集中在抗腫瘤方面，研究發現斑蝥素可抑制多種腫瘤細胞的增殖和侵襲，其發揮作用與抑制細胞內NF-κB p65核轉位密切相關[20]。最近也有體外研究發現，斑蝥素可顯著抑制人臍血管內皮細胞增殖，遷移和血管形成[18]。因此，我們推測斑蝥素與VSMCs過度增殖和遷移引起的血管再狹窄具有密切的聯系，而這種聯系與炎癥反應相關。本研究通過體外分離培養大鼠VSMCs，用斑蝥素處理經脂多糖誘導炎癥反應的VSMCs，結果發現斑蝥素可顯著降低脂多糖誘導的VSMCs炎癥反應，并抑制VSMCs的增殖和遷移。

眾所周知，NF-κB信號通路在炎癥相關疾病中扮演著重要的作用。NF-κB由p50和p65兩個亞基組成。Landry等[21]發現，在大鼠頸動脈球囊損傷后p50和p65被激活，而它們的抑制性蛋白IκB-α水平顯著降低。事實上，抑制NF-κB信號通路激活可抑制VSMCs增殖和遷移，從而減少血管損傷后新生內膜的形成[22]。這些結果與我們在體外研究結果基本一致。我們發現體外培養的VSMCs在脂多糖刺激后其NF-κB信號通路顯著激活，其下游促炎因子包括TNF-α、 IL-6、MCP-1的表達顯著增加，細胞增殖和遷移能力也明顯增強；而在斑蝥素處理后胞內NF-κB抑制性蛋白IκB-α表達增加，NF-κB p65磷酸化受阻，TNF-α、IL-6、MCP-1的表達降低，細胞增殖和遷移能力也隨之下降。這提示，斑蝥素可通過抑制NF-κB信號通路的激活而降低VSMCs的增殖和遷移能力。

總之，我們的實驗結果表明，斑蝥素可顯著抑制脂多糖誘導的VSMCs的增殖和遷移，而發揮作用的機制至少部分與斑蝥素抑制NF-κB信號通路激活有關。這為進一步研究斑蝥素對VSMCs生物學活性的作用奠定了基礎，為治療與VSMCs功能密切相關的動脈粥樣硬化及血管再狹窄提供了理論基礎。