菌藻共生提高小球藻生物量和產油率

張靖潔 段露露 程蔚蘭 季春麗 崔紅利 李潤植

（山西農業大學分子農業與生物能源研究所，太谷030801）

微藻是一類能進行光合自養且廣泛分布于自然界的低等植物，因其生長速率快、生物量大和能高水平合成積累多種天然化合物而被人類廣泛利用。微藻基生物產品目前已經應用于生物制藥、化妝美容、醫療保健，生物染料、畜禽養殖和水產等行業中［1-3］。利用微藻生產優質生物柴油已成為當今國內外研究的熱點之一［4-5］，現已對優質富油藻種選育［6］、規模化培養體系及油脂富集調控技術和制油工藝［7］等進行了諸多研究，微藻生物柴油產業化呈現良好前景，盡管成本高和存在一些限制因素。

提高微藻生物質和油脂產量是規模化制備生物柴油或高值藻油產品的關鍵環節。然而，微藻規模化培養過程中常有伴生細菌污染，尤其是微藻藻際微環境中存在一些不易去除的細菌。現今對這些伴生或共生的細菌與微藻互作機制以及對微藻生長和目標產物積累的影響還知之甚少。一些研究指出［8-10］，微藻和細菌密不可分，經過長期自然進化，真核微藻與原核細菌之間形成復雜的相互作用，包括營養依賴、代謝互補等多種方式。而且，藻菌互作是動態的，能對不同環境做出響應。

目前，已有研究證明［11］，菌藻共生系統可以用于對工廠、市政和養殖等各種污水進行高效處理，具有良好的經濟、環境和社會效益。有關在微藻規模化養殖中，應用有益藻菌共生體系以期獲得高量微藻生物質和生產生物燃油等其他藻基產品還未見詳盡報道。

本文以前期篩選獲得的埃氏小球藻（Chlorella emersonii）藻株SXND-25為試材，分離鑒定藻際細菌菌群，篩選優勢促生菌，人工構建藻菌共生體系，分析促生菌對小球藻作用，建立了能顯著提高微藻生物量和產油量的藻菌共生體系。據此提出了在微藻規模化養殖中，通過建立調節藻際有益菌豐度的藻菌共生體系以期高效生產微藻生物質和其他高值藻基產品的技術策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種與培養基 實驗所采用的藻種是本實驗室從山西一煤化廠附近水體中分離純化的藻株，經18S rDNA鑒定其為埃氏小球藻（Chlorella emersonii）的一個新株系，命名為SXND-25。埃氏小球藻用BG11培養基培養。

1.1.2 菌株與培養基 實驗所使用的菌株是在培養埃氏小球藻的過程中，從藻際微環境分離出來的6個細菌菌群/種，經過16SrRNA鑒定，分別屬于鶉雞腸球菌（Enterococcusgallinarum）、大腸桿菌（Escherichia coli）、假單胞菌（Pseudomonas）和菠蘿泛菌（Pantoea）4個屬。菌株用牛肉膏蛋白胨培養基培養。

1.2 方法

1.2.1 藻種的分離、純化與鑒定 將采集到的水樣加入BG11培養基，置于光照培養箱培養。培養條件為：溫度（25±1）℃，濕度45%，光照強度4 500 lx，光暗比16 h∶8 h，每天定時搖動3次。用平板涂布法將藻液稀釋分離，待長出單細胞藻落，用接種環挑單株落于液體培養基培養。純化方法是重復平板涂布和挑單株培養，直至培養皿上沒有雜菌和雜藻為止。

純化的藻種在達到一定的生物量后離心獲得濕藻液，冷凍干燥后獲得干藻粉，參照程蔚蘭等［12］用CTAB法提取藻DNA，用18S rDNA為引物進行PCR擴增，測序后在數據庫中進行序列比對，用鄰接法在MEGA7.0中構建系統發育樹，鑒定藻種。

1.2.2 菌群/種的分離、培養與鑒定 根據小球藻生長曲線，在生長初期、對數生長期、穩定期各取藻液1 mL，分別稀釋105-108倍。每10倍為一個梯度，各濃度梯度重復3次。平板涂布于固體牛肉膏蛋白胨培養基中，做好標記。2-3 d后，觀察并記錄固體培養基中菌落形態特征，挑取固體培養基中形態特征不同的單菌落分裝于牛肉膏蛋白胨液體培養基中，作好標號，擴繁培養。

菌液離心獲得菌體，提取細菌DNA，用16S rRNA為引物進行PCR擴增，序列對比后用鄰接法在MEGA7.0中構建系統發育樹，從而鑒定出菌群的種屬。

1.2.3 優勢促生菌種/群的篩選 在1 L BG11中接種初始小球藻0.2 g，實驗組分別加入藻菌比（細胞數）為1∶1的6個菌株/群進行混合培養。菌液經8 000 r/min離心5 min，棄上清。菌體沉淀用20 mL BG11培養基重懸后，接入小球藻的培養體系中。對照組為小球藻培養，在小球藻培養體系中加入 20mL BG11培養基，每組設置3次重復。檢測培養一定時期的藻體生物量和藻細胞油脂積累等性狀，以確定促進微藻生長的優勢菌群/種。

1.2.4 菌藻共生體系的構建 實驗組選用優勢菌種/群，將菌液接入到小球藻對數期培養體系（藻體干重為0.2 g/L，體積為1 L）中，分別設置藻菌比為 10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10 等組合進行共培養。每組設置3次重復，對照組為小球藻單獨培養（藻干重為0.2 g/L，體積為1 L）。

1.2.5 小球藻尼羅紅染色和油脂含量及成分測定 將800 μL藻液與200 μL二甲基亞砜（DMSO），10 μL尼羅紅丙酮溶液（0.1 mg/mL）均勻混合，42℃條件下避光水浴5 min。使用藍光作為激發光，在正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

本實驗提取油脂的方法是直接轉酯化法：將 5 mg凍干藻粉、0.1-0.3 mL氯仿∶甲醇（2∶1，V/V）、0.1-0.5 mL HCl-甲醇（5%，V/V）依次加入特氟龍密封墊片的玻璃螺紋管中。85℃水浴30 min，冷卻至室溫后，加入900 μL正己烷。將其在設定條件為25℃，150 r/min的搖床上萃取1 h。靜置過夜后，取上清正己烷萃取液，參照張飛等［13］描述的方法，使用氣相色譜儀（GC）（Agilent 7890D）測定脂肪酸組成及含量。色譜柱為Agilent HP-88弱極 性 毛 細 管 色 譜 柱（30 m×250 μm×0.25 μm），樣品1 μL分流進樣，分流比1∶40進樣口溫度260℃。使用氮氣作為載氣，流速為1.0 mL/min。計算各組分的百分含量：峰面積歸一化法。實驗重復3次。

1.2.6 數據處理 實驗數據經Excel整理后進行統計和作圖，采用SPSS軟件t檢驗進行分析。實驗數據表示為3次重復的平均值±標準差，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 藻株形態學及分子鑒定

分離出的單株藻在光學顯微鏡下觀察細胞形態為綠色，圓球形（圖1），初步鑒定為一株小綠藻。經18S rDNA擴增，PCR產物大小為1 798 bp（圖2），測序并與已有微藻18S rDNA序列比對構建系統進化樹顯示，此藻種與埃氏小球藻（KX395729.1）的距離最近（圖3），但其序列相似度為98%，并不是同一株系，最終鑒定此藻種為埃式小球藻的一個新株系，命名為SXND-25。

圖1 純化的藻種在光學顯微鏡下的形態

2.2 埃氏小球藻油脂含量和脂肪酸成分分析

用尼羅紅染料對小球藻細胞染色，在熒光顯微鏡下定性觀察油脂儲存情況（圖4），可以看到油體在細胞內均勻分布。提取油脂、GC測試結果顯示，此種小球藻含油量為28.25%，油脂成分中單不飽和脂肪酸（16∶1和18∶1）含量占總油脂含量的13.50%（圖 5）。

2.3 埃氏小球藻藻際共生菌菌落形態和菌的鑒定

將分離到的細菌涂布于細菌培養基，培養至菌落形成，觀察菌落形態（圖6），包括菌落大小、表面黏稠程度、顏色、邊緣特征，將菌落分成6個不同菌種（表1）。挑去單個菌落，分別純化培養后，提取基因組DNA，進行16S rRNA測序鑒定。序列比對（圖7）顯示1號和4號菌種為腸桿菌科的菠蘿泛菌屬（Pantoea），5號菌種為腸桿菌科的大腸桿菌屬（Escherichia coli），2號和6號菌種是假單胞桿菌科的假單胞菌屬（Pseudomonas），3號菌種是腸球菌科的鶉雞腸球菌屬（Enterococcus gallinarum）。

圖2 藻株基因組DNA（A）和藻株18S rDNA PCR產物（B）

圖3 幾種微藻18S rDNA序列的系統進化樹分析

圖4 尼羅紅染色后的埃氏小球藻在熒光顯微鏡下的油體分布

圖5 埃氏小球藻的總油脂含量（W/W）及各脂肪酸相對含量（%）

圖6 菌落的形態

表1 來自埃氏小球藻藻際6個細菌菌落的形態及特征

2.4 六株共棲菌對埃氏小球藻生物量的影響及優勢促生菌的篩選

將埃氏小球藻與6株共棲菌分別以1∶1比例組合，連續8 d共培養，檢測微藻生物量（圖8）表明，6株共棲菌中，菌株3鶉雞腸球菌和菌株5大腸桿菌抑制了微藻的生長，其中抑制作用最強的菌株為菌株3。其余4株共棲菌促進了微藻的生長，菌株2假單胞菌的促進作用最顯著，微藻生物量達到4.12 g/L，比對照組增長1.32 g/L，增長量占對照組生物量的47.14%；其次是菌株4菠蘿泛菌的促進作用明顯微藻生物量達到3.73 g/L，比對照組增長0.93 g/L，增長量占對照組生物量的33.21%。據此，篩選出促進微藻生長的優勢促生菌株/群為2號和4號菌種，即假單胞菌和菠蘿泛菌，用于下一步埃氏小球藻藻菌共生體系的構建。

圖7 六個菌種及其他已知菌種18S rDNA序列的系統進化樹分析

圖8 六株共棲菌對埃氏小球藻生物量的影響

2.5 埃氏小球藻與假單胞菌共生體系的構建及對微藻生長的影響

構建埃氏小球藻與假單胞菌不同配比（10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10）藻菌共生體系，分別共培養8 d，檢測每天的生物量和第8天的藻細胞含油量。結果表明（圖9），藻菌比和生物量呈先增后減的趨勢。在藻菌比例為1∶1時，第8天生物量高達4.12 g/L，相比對照組增長了1.32 g/L，增長率為47.14%，此時油脂含量為29.50%，相比對照組增長了1.25%，增率為4.42%。埃氏小球藻和假單胞菌共生體系中，生物量和油脂含量在1∶1以前呈正相關（圖10），其后隨著藻菌比的降低，小球藻的生物量和含油率均減低。

圖9 埃氏小球藻與假單胞菌共生體系生物量變化情況

圖10 埃氏小球藻與假單胞菌共生培養第8天的微藻生物量和油脂含量

2.6 埃氏小球藻與菠蘿泛菌共生體系的構建及對微藻生長的影響

構建埃氏小球藻與菠蘿泛菌不同配比（10∶1、5∶1、1∶1、1∶5、1∶10）藻菌共生體系，分別共培養8 d，檢測每天的生物量，結果表明（圖11）當藻菌比例為1∶5時，埃氏小球藻生物量最大，第8天生物量為5.86 g/L，相比對照組增長了3.06 g/L，增長率為109.29%。

取微藻培養第8天藻樣，檢測藻細胞含油量。圖12顯示，藻細胞油脂含量與生物量趨勢相反，藻菌比例與油脂含量的趨勢先減后增。當藻菌比例為1∶5時，藻細胞油脂含量降低為26.88%，相比對照組降低了4.85%。

圖11 埃氏小球藻與菠蘿泛菌共生體系微藻生物量變化

圖12 埃氏小球藻與菠蘿泛菌共培養第8天的微藻生物量和油脂含量

2.7 藻菌共生體系對微藻脂肪酸組成的影響

構建埃氏小球藻與假單胞菌比為1∶1的共生體系1以及埃氏小球藻與菠蘿泛菌比為1∶5的共生體系2，分別培養8天后，檢測藻細胞各脂肪酸成分含量，并計算飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）和多不飽和脂肪酸（PUFA）的含量。檢測結果表明（表2）共生體系1和共生體系2中MUFA含量比對照組均有提高。共生體系2中藻細胞MUFA含量提高更顯著，比對照增加了162.96%，同時飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸相應地降低。在藻菌共生培養體系中，藻細胞油脂的總產量均比對照組高（表3），且共生體系2總油脂產量高達1 575 mg/L，共生體系1次之。然而，共生體系2中的MUFA產量遠高于共生體系1，達554-564 mg/L，其中油酸（C18∶1）比對照組顯著提高。單不飽和的油酸和棕櫚油酸（16∶1）是制取優質生物柴油的理想脂肪酸成分。因此，共生體系2更適合應用于生產生物柴油的規模化培養。

表2 埃氏小球藻及其藻菌共培養第8天藻細胞各脂肪酸含量（%）

3 討論

微藻生長自然水體以及微藻規模化培養過程中，其藻際微環境常存在一些不易徹底分離和去除的細菌菌群，包括抑藻菌、溶藻菌和促生菌以及依賴菌等。Amin［14］和張晶等［15］對自然水體中藻菌共生體系研究揭示，細菌為微藻的生長提供了CO2，同時可以分解有機物，固定無機氮；微藻則提供了O2促使菌的生長。在微藻純化培養過程中，添加抗生素只殺死了部分外部菌，有益的共生菌則會因藻種的協助得以生存。將促生菌與目標微藻構建藻菌共生體系，已應用于各種廢水處理，廢水凈化及資源化利用效果明顯。

表3 埃氏小球藻及其藻菌共培養第8天總油脂及飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸產量（mg/L）

通過構建優勢促生菌種與埃氏小球藻的共生體系，我們研究發現，埃氏小球藻與假單胞菌（Pseudomonas）1∶1組合（共生體系1），以及埃氏小球藻與菠蘿泛菌（Pantoea）1∶5組合（共生體系2），不僅能顯著提高微藻生物量，還促進藻細胞油脂合成積累。共生體系1在培養8 d時，微藻油脂含量由28.25%增長到29.50%，油脂總產量由791 mg/L增長到1 215 mg/L。雖然共生體系2的油脂含量有所降低，但是在生物量提高較大，最終微藻總油脂產量由791 mg/L增長到1 575 mg/L。其他一些人工構建藻菌共生體系研究亦顯示有益共生菌可促進微藻生物量和油脂積累的增加［16-18］。例如，Suminto 等［19］研究表明，黃桿菌屬對小球藻的生長具有促進作用。史玉倩等［20］報道菠蘿泛菌也可以促進小球藻生長和油脂積累，Mouget等［21］的結果顯示，假單胞菌（Pseudomonas）對小球藻（Chlorella）和柵藻（Scenedesmusobliqnus）的生長都有促進作用。

需要指出的是，不同種屬的細菌與不同微藻的互作效果差異較大。章登嵐［22］研究表明假單胞菌（Pseudomonassp.）會導致微囊球藻（Microcystis aeruginosa）的死亡，從而降低了微囊球藻的生物量。Abed等［23］的研究則顯示，假單胞菌（Pseudomonas）能促進藍藻（Cyanobacterial）—也稱藍細菌生物量提高8倍。本研究從埃氏小球藻藻際分離鑒定出6種不同菌種，其中2個菌種抑制微藻生長，4個菌種促進微藻生長，假單胞菌（Pseudomonas）和菠蘿泛菌（Pantoea）促生效果極為顯著。

盡管本研究未檢測藻菌互作具體機制，可能是抑生菌為了競爭養分產生了抑制小球藻生長的物質，從而殺死部分埃氏小球藻，而促生菌有可能產生能促進微藻生長的物質，導致埃氏小球藻生物量增加。本文中假單胞菌（Pseudomonas）對小球藻的生物量和油脂含量均有顯著提高，是最值得關注的問題。尚海［10］等做電鏡顯示細菌與藻細胞以胞外連體的形式共生。共生狀態下的假單胞菌隨著藻細胞的大量繁衍，逐漸處于一種脅迫狀態，可能通過胞外連體錯誤地向藻細胞傳遞脅迫信號，藻細胞接受脅迫信號從而調節了自身的油脂代謝途徑。可進一步分離測得共生菌的細胞數和油脂含量來驗證。

另外，一些研究表明，假單胞菌（Pseudomonas）和菠蘿泛菌（Pantoea）是一些高等植物的病原菌［24-25］。例如，顧沁等［26］報道菠蘿泛菌是玉米葉脈產生黃色斑點的致病菌。菠蘿泛菌也是多肉植物褐腐病的致病菌［27］。然而，這兩個菌卻能顯著促進埃氏小球藻及其他一些微藻的生長。可見，藻菌共生及互作效果具有種屬專一性。小球藻作為單細胞真核生物，經與共生菌協同進化，藻細胞可能釋放一些抑制周圍其他生物的活性成分，使得菠蘿泛菌不會像危害高等植物那樣抑制小球藻生長，反而小球藻能適當控制菠蘿泛菌的生物量，存活的菠蘿泛菌可不斷地提供CO2和其他營養促進小球藻的快速生長，二者處于協作共生狀態。進一步檢測微藻產生何種物質或信號分子能有效控制這兩種植物病原菌的生長，可為研發藻源功效成分及其在農作物生產上應用提供了理論依據。

微藻總油脂產量和脂肪酸構成（特別是單不飽和脂肪酸）是微藻用于制備優質生物柴油和高值微藻油脂產品的兩個關鍵因素。本研究另一個重要發現是，所構建的兩個藻菌共生體系均能顯著提高藻細胞油脂中單不飽和脂肪酸（十六烯酸和十八烯酸）合成積累量，尤其是共生體系2效果更強。這可能是菌藻共生互作所調控的結果。隨著藻菌共生體系培養時間延長，氮源供應量下降，造成體系進入氮脅迫狀態。為應對氮脅迫，微藻積累更多油脂和具有高抗氧化活性的單不飽和脂肪酸［28］，具體機制還有待進一步研究。從制備油脂生物燃油和高端藻油產品出發，可選用共生體系2進行埃氏小球藻規模化高效養殖。

4 結論

本研究篩選到一株生長快、含油量高（＞28%，干重百分比）的優異埃氏小球藻藻株，并從其藻際微環境分離鑒定出6種不同的細菌菌種。成功構建了埃氏小球藻與2種優勢促生菌（假單胞菌和菠蘿泛菌）分別組合的有益藻菌共生體系。研究表明，通過構建藻菌共生體系，適當調控優勢促生菌的豐度，可顯著提高微藻生物量及總油脂和單不飽和脂肪酸的產量。這為探究藻菌互作和規模化養殖微藻以制備優質生物燃油或高值微藻油脂產品提供了一條新策略。