中高溫大曲發酵過程微生物消長規律探析

李燕榮，楊 勇，張龍云，譚洪弟，姜 雷，郭風雪，宋 寶

（江蘇洋河股份有限公司，江蘇宿遷223800）

古語有云：“曲乃酒之骨也”，洋河綿柔型風格白酒的釀造自然離不開綿柔型中高溫大曲。大曲在白酒釀造中既是糖化劑、發酵劑又是生香劑，不但含有豐富的微生物區系和酶系，還蘊含白酒風格形成的各種呈香呈味前體物質，同時還作為釀酒的原料，因此大曲在釀酒生產中的作用不言而喻，其品質好壞決定著酒的風格及檔次。

本文對中高溫大曲制作發酵期全流程進行跟蹤取樣，并首次將曲樣細分為曲皮樣和曲心樣，分別針對曲皮和曲心中的微生物消長變化規律進行研究分析，著力探析發酵期綿柔型中高溫大曲由外及里微生物的動態消長變化規律，旨在全面剖析發酵期大曲微生物更迭全過程，為制曲工藝優化和現代化制曲提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

曲樣：采樣方法見1.3.1。

儀器設備：酒精溫度計，粉碎機，高壓蒸汽滅菌鍋，超凈操作工作臺，1 mL移液槍，200 μL移液槍，玻璃涂布棒，恒溫培養箱。

1.2 培養基

營養瓊脂培養基：牛肉膏1.0 g，酵母膏2.0 g，蛋白胨5.0 g，氯化鈉5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4。

孟加拉紅培養基：蛋白胨5.0 g，葡萄糖10 g，磷酸二氫鉀1.0 g，硫酸鎂0.5 g，孟加拉紅0.03 g，瓊脂20 g，氯霉素0.1 g，水1000 mL，pH 7.2±0.2。

1.3 試驗方法

1.3.1 取樣

對發酵期全流程進行跟蹤并取樣，將曲樣分為曲皮樣和曲心樣，取樣詳情見表1。

將曲皮樣和曲心樣依據軟硬情況，用粉碎機進行粉碎，過40目篩備用。

1.3.2 曲樣微生物數的檢測

梯度稀釋涂布法：取5.0 g大曲粉，加入裝有玻璃珠和50 mL無菌水的三角瓶中搖勻，經30 min充分浸提和靜置后，用1 mL移液槍吸取1.0 mL上清液于裝有9.0 mL無菌水的試管中，制成10-2梯度的稀釋液，吸取該梯度的稀釋液1 mL于裝有9.0 mL無菌水的試管中，依照此操作次序制成10-3、10-4、10-5梯度的曲樣浸出液。隨后用200 μL移液槍分別取 10-1、10-2、10-3、10-4和 10-5梯度的稀釋浸出液200 μL于營養瓊脂培養基和孟加拉紅培養基中，用無菌的涂布棒均勻涂布后分別置于37℃培養箱和30℃培養箱中培養。營養瓊脂板倒置培養24 h后取出檢測細菌數量，孟加拉紅板倒置培養36 h后取出檢測酵母菌菌落數，48 h后取出檢測霉菌數量。

表1 發酵各階段取樣匯總表

說明：正值伏天取樣，以上培養基需放置在室內溫度為25～27℃的環境中，方能正常使用，并實現上述各項操作。

1.3.3 曲樣溫度測定

對曲房四周和中心曲塊的溫度進行跟蹤測定。具體操作方法是將酒精溫度計插入曲樣正中心位置，每日下午3時～5時定點查看曲塊溫度并記錄。

1.3.4 曲樣水分檢測

將干燥箱溫度調至130℃，待溫度恒定后放入試樣，烘烤60 min后取出，繼而進行水分測算。

2 結果與分析

2.1 發酵期大曲溫度

中高溫大曲發酵周期為31 d，大曲發酵期溫度變化及趨勢（該實驗跟蹤的是7月份制大曲，發酵期大曲溫度變化趨勢會隨季節有一些波動）見表2。由表2可知，在第1天和第2天主發酵階段，曲溫緩慢上升，該階段大曲主要完成“穿衣”，曲皮被一層霉菌菌絲覆蓋。此時霉菌菌絲進入曲皮，可引出曲塊中的水分，而不至于使大曲中的水因無出口而膨脹裂口，素有“菌絲內插，水分揮發”的培養原理，自此每個曲塊形成了一個“微氧”“獨立”的小生態環境[1]。并房操作時，曲溫略有下降。發酵第4天曲塊溫度和濕度急劇升高并進入潮火期，此時曲塊溫度在51～53℃之間；再經過2 d持續升溫后，大曲發酵進入大火期，此時曲塊溫度可達60～61℃，這個溫度可以持續5～6 d（占火期），占火期后曲塊溫度開始回落，回落速度平穩，進入后火期，該階段的曲塊溫度也是緩慢下降。整個發酵期大曲溫度變化符合“前火不可過大，后火不可過小，多熱少涼不閃火”的規律[2]。之后，曲塊進入養曲期，此時溫度緩慢下降直至室溫。

表2 發酵各階段曲塊溫度表

2.2 發酵期大曲水分

大曲制作期水分變化及趨勢見表3。由表3可知，曲塊發酵的前12 d，曲皮水分散失較快，水分從37.96%下降到11.45%，曲塊水分平均每天散失近2.2%，12 d后曲皮水分變化緩慢，處于較穩定狀態，而與曲皮水分變化截然不同的是，曲心水分在10 d前變化幅度不大，每天下降約0.21%，但從12 d開始，隨著曲溫不斷升高，曲心水分揮發幅度加劇，從表3曲心水分變化數據可知，這段時間水分呈直線下降趨勢，在大曲發酵后期短短16 d中，曲心水分從35.90%直線下降到13.16%，平均每天下降約1.42%，與前期10 d每天下降0.21%相比可知，曲心水分在大曲發酵后期隨著曲心溫度的不斷升高及微生物的大量繁殖而加劇消耗揮發。

表3 發酵期大曲水分

2.3 細菌動態變化規律

細菌是大曲的“生香動力”，是多種香味物質產生的源泉[3]。大曲發酵期細菌數量變化幅度小，且在微生物總數上占據絕對優勢。由表4可知，主發酵階段曲皮細菌數量即達到峰值，整個大曲發酵期間，曲皮細菌數量始終多于曲心，除了第7天、第8天和第9天，這3 d的曲心細菌數量多于曲皮，并且曲心處細菌在發酵第9天達到峰值，結合曲塊水分和溫度共同分析，這期間曲塊溫度迅速升高至大火期，曲皮水分散失嚴重，不能滿足微生物的繁殖所需，而此時曲心水分充足，曲心處“高濕”“微氧”的環境極利于微生物的生長，尤其是耐高溫芽孢桿菌的生長繁殖[4]。大曲發酵后火階段，隨著曲塊溫度的回落，曲心處細菌數量大幅減少，直至此后的其他階段，曲心細菌數量變化不大，而與此同時曲皮處細菌數量由于曲溫的下降，加上“微氧”“微濕”的微環境所致，其細菌數量反而呈現回升勢頭。從表4也能看出，在發酵后期第10天起，曲皮細菌數量增值幅度顯著高于曲心，而此時曲心處細菌數量變化曲線表現平穩，變化幅度小，幾乎無變化。

表4 發酵期大曲曲皮和曲心細菌數量

2.4 霉菌動態變化規律

霉菌具有較強的糖化酶兼具蛋白水解酶合成功能，與大曲的糖化力和液化力顯著相關[5]。從表5可知，整個發酵期曲皮處霉菌數量變化幅度較大，曲皮和曲心的霉菌在主發酵階段和并房潮火階段均達到峰值，此時曲皮霉菌數量可達107cfu/g，曲心霉菌數量則在104cfu/g，曲皮霉菌數量是曲心的數千倍。隨著曲溫的不斷升高，大火期曲皮和曲心處的霉菌顯著減少。此時曲皮霉菌數量維持在105cfu/g，是曲心的數百倍，兩者最大差距可達數千倍。后火階段和養曲階段，曲皮霉菌數量是“一跌再跌”。大曲發酵期末，曲皮霉菌數維持在103～104cfu/g。曲心霉菌數自大火期始，數量變化不大，數量穩定維持在幾百個。從這期間霉菌數的變化可知，霉菌的繁殖對于氧氣和濕度要求較細菌菌落嚴格，而且對于溫度敏感，高溫是霉菌的“天敵”，這也就解釋了曲皮霉菌數始終遠高于曲心的霉菌數量的現象。在發酵前期，曲塊濕度較大，曲皮處氧氣含量充足，此時霉菌得以大量繁殖，而此時曲心處尚存有少量氧氣，且濕度較大，故曲心處霉菌也得以繁殖，而隨著曲溫的升高以及曲心氧氣的不斷消耗，曲心處霉菌繁殖缺乏了適宜的溫度，同時又缺氧，自此其數量是“一落千丈”。

表5 發酵期大曲曲皮和曲心霉菌數量

2.5 酵母菌動態變化規律

酵母菌是發酵之母，是酒精發酵的主要動力。從表6可知，曲皮和曲心酵母菌在發酵第1天即達到頂峰，第2天開始回落，這與酵母菌極其不耐熱的特性是緊密相關的。由表2可知，大曲發酵第1天曲塊溫度為44℃，第2天曲塊溫度已達到47℃，不同的酵母菌耐熱程度是不一樣的，一般的酵母菌能夠在37℃以下生長，如果是固體發酵的話，溫度達到45℃影響也不是特別大，溫度再往上升，死亡率就特別高了[6]。主發酵期間，曲皮酵母菌和曲心酵母菌數量相當，均達到峰值（107cfu/g），此時曲皮和曲心都處在一個溫度不是特別高，濕度適宜的狀態；并房后至潮火期，曲塊溫度由表及里逐漸升高，曲皮溫度小于曲心溫度，曲皮酵母菌（104～105cfu/g）比曲心酵母菌（103～104cfu/g）多一個數量級；進入大火期后，曲皮和曲心溫度均超過50℃，曲心溫度更是高達60℃，在這個溫度下是沒有酵母菌能夠存活，因此自大火期后不管是曲心還是曲皮，受制于溫度的影響，酵母菌菌落在10-1曲樣梯度稀釋液中未有檢出，但不排除大曲樣中有酵母菌，可通過液態培養基進行酵母菌的富集試驗進行進一步的佐證。

表6 發酵期大曲曲皮和曲心酵母菌數量

3 結論

微生物的生長繁殖與其存在環境中的水分和溫度是分不開的，這兩個指標對于微生物的生長具有決定性的作用，因此本研究結合了發酵期各階段的溫度和水分指標，對發酵期綿柔中高溫大曲的細菌、酵母菌和霉菌3種主要微生物動態變化進行了總結分析，初步明晰了各自的消長規律。

正如文中所說細菌是“生香動力”，霉菌是“糖化動力”，酵母菌是“發酵動力”，但是這些指標都是相互作用的，不能孤立著看，要完整剖析大曲發酵期的動態變化，達到充分認識這個動態變化過程，并將之指導與應用于大曲生產實踐中去，需要盡可能多地對發酵過程中的各因子去做分析，并做好相關性分析，因此下一步將對發酵期的主體微生物及其相關酶活等理化指標進行研究分析，同時結合本文的微生物動態消長規律，最大程度地揭示大曲發酵培養全過程的內在機理，以期為機械化制曲及制曲工藝優化提供扎實的理論指導。