月季花總黃酮對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型腦組織NO、NOS水平及含水量的影響

周紅敏，周淑娟

(鄭州市第六人民醫(yī)院，河南 鄭州 450015)

月季花為薔薇科植物月季(RosachinensisJacq.)的花蕾和初開放的花，遍布我國大部分地區(qū)。月季花具有很高的觀賞價(jià)值，也具有很高的藥用價(jià)值，其性味甘、溫，主入肝經(jīng)，具有活血調(diào)經(jīng)、消腫解毒的功效，臨床內(nèi)服可用于治療月經(jīng)不調(diào)、經(jīng)閉、痛經(jīng)，外敷治療癰癤腫毒、瘰疬、跌仆瘀腫。何英萍[1]總結(jié)相關(guān)治療月經(jīng)不調(diào)經(jīng)驗(yàn)方發(fā)現(xiàn)，月季花3～5朵、黃酒10 g、冰糖適量加水煎服具有行氣活血的功效，適用于氣滯血瘀所致閉經(jīng)、痛經(jīng)等癥。月季花中含有多種化合物，如槲皮素、山奈黃素、鼠李糖苷、胡桃苷等，主要含黃酮和酚酸類化合物，同時(shí)也是其主要活性成分[2]。近現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，月季花具有很強(qiáng)的抗菌、抗病毒、抗氧化作用。袁克星等[3]探討月季花色素對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)能力及抗氧化能力的影響，發(fā)現(xiàn)月季花色素可顯著增強(qiáng)小鼠體內(nèi)多種抗氧酶的活性，提高小鼠運(yùn)動(dòng)能力。有文獻(xiàn)報(bào)道，月季花可抑制腫瘤，具有抗癌作用，同時(shí)對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫也有顯著作用[4]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型小鼠腦組織勻漿中NO、NOS水平，以及血清中NSE和腦組織含水量的檢測(cè)，探討月季花總黃酮對(duì)小鼠腦缺血后可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

月季花總黃酮：含量(總黃酮)50%，由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供；腦絡(luò)通膠囊由四川泰華堂制藥有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

KM小鼠，雄性，SPF級(jí)，24～26 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(豫)2015-0001。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

UV1000單光束紫外/可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；玻璃勻漿器(鄭州玻璃儀器廠)；可調(diào)式移液器(上海雷勃分析儀器有限公司)；KDC-160HR高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海基瑋試驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

羧甲基纖維素鈉(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；神經(jīng)元烯醇化酶(NSE)ELISA檢測(cè)試劑盒(北京誠林生物科技有限公司)；一氧化氮(NO)試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)試劑盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

取KM雄性小鼠84只，SPF級(jí)，實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3天，稱重隨機(jī)分為6組，即假手術(shù)組、模型組、腦絡(luò)通組(0.75 g/kg)和月季花總黃酮組高、中、低劑量組(0.4 g/kg、0.2 g/kg、0.1 g/kg)，除假手術(shù)和模型組外，其余各組給予相應(yīng)藥物，1天1次，連續(xù)給藥7 d，于第6 d晚八點(diǎn)禁食不禁水12 h，第7 d早給藥1 h后進(jìn)行手術(shù)，制造小鼠反復(fù)再灌注模型。10%水合氯醛小鼠腹腔注射麻醉(0.35 g/kg)，并仰臥固定于鼠板上，頸部剃毛酒精消毒后正中切口，精密分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)周圍肌肉和神經(jīng)，穿線備用。用微動(dòng)脈夾同時(shí)夾閉雙側(cè)CCA 10 min后，松開微動(dòng)脈夾，使小鼠腦部恢復(fù)供血10 min，再進(jìn)行第二次夾閉阻斷血流10 min，再松開，給予適量青霉素，縫合傷口，于第8 d早上給藥1 h后進(jìn)行取材。注意實(shí)驗(yàn)室溫度控制在25℃左右，假手術(shù)組僅分離雙側(cè)CCA但不阻斷血流[5]。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)

1.6.1 血清的制備

各組小鼠缺血再灌注22 h后進(jìn)行摘眼球取血，靜置1 h待血液分層，低溫離心10 min，3 500 r/min，移液槍取上層血清冷凍備用，測(cè)定血清中NSE水平。

1.6.2 腦勻漿的制備

取血后小鼠脫頸椎處死，迅速剝腦，按矢狀線將小鼠腦組織分為兩半，切除小腦和嗅球。取其中一半，用冰生理鹽水沖凈腦組織表面血液，濾紙沾干，精確稱取腦組織重量，加入9倍生理鹽水充分勻漿，制成10%腦組織勻漿液，低溫離心10 min，3 000 r/min，移液槍取上清液冷凍備用，測(cè)定腦勻漿中NO、NOS水平。

1.6.3 腦組織含水量測(cè)定

取另一半腦組織，沖凈表面血跡，濾紙沾干后精密稱重，為腦組織重量A(濕重)，將腦組織置于105℃烘箱中連續(xù)烘干48 h置恒重，即為重量B(干重)，運(yùn)用公式計(jì)算腦組織含水量[6]。

腦組織含水量(%)=(A-B)/A×100%

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 月季花總黃酮對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型死亡率的影響

除假手術(shù)組外，術(shù)后其余各組均呈現(xiàn)出不同程度死亡現(xiàn)象。其中，模型組死亡率最高，為28.57%，且模型組動(dòng)物不同程度出現(xiàn)神經(jīng)癥狀缺失現(xiàn)象，精神萎靡，不活躍，甚至出現(xiàn)走路傾倒或意識(shí)喪失等現(xiàn)象；陽性藥腦絡(luò)通組相較于模型組，動(dòng)物術(shù)后狀態(tài)得到大幅度改善，并且死亡率僅為14.29%；月季花總黃酮各組對(duì)小鼠不論是術(shù)后狀態(tài)還是死亡率，均有不同的改善作用，其中以月季花總黃酮高劑量組效果最好，死亡率降低至10%以下，且術(shù)后動(dòng)物較為活躍，狀態(tài)比模型組有很大提升。結(jié)果見表1。

表1 各組對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型死亡率的影響

2.2 月季花總黃酮對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型血清中NSE含量的影響

由表2可得，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠血清中NSE含量大幅升高(P<0.01)，說明小鼠反復(fù)缺血再灌注模型造模成功。與模型組相比，陽性藥腦絡(luò)通組可顯著下調(diào)小鼠血清中NSE水平(P<0.01)，有明顯改善作用；月季花總黃酮高劑量組可顯著降低小鼠血清中NSE含量(P<0.01)，中劑量和低劑量可明顯降低小鼠血清中NSE含量(P<0.05)，說明月季花總黃酮可改善小鼠缺血損傷后血清中NSE水平，高劑量月季花總黃酮效果最佳。

表2 各組對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型血清中NSE含量的影響

注：與假手術(shù)組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

2.3 月季花總黃酮對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型腦組織勻漿中NO、NOS水平的影響

由表3可得，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織勻漿中NO含量大幅增加，NOS的活性也大幅上調(diào)(P<0.01)，提示小鼠反復(fù)缺血再灌注模型造模成功。與模型組相比，陽性藥腦絡(luò)通組可顯著降低小鼠腦組織中NO的水平(P<0.01)、顯著下調(diào)NOS活性(P<0.01)；月季花總黃酮各組對(duì)NO、NOS也有明顯的改善作用，其中高劑量可顯著降低腦組織勻漿中NO、NOS水平(P<0.01)，中劑量組可明顯降低腦組織勻漿中NO、NOS水平(P<0.05)，低劑量組可明顯降低NOS活性(P<0.05)，對(duì)腦組織中NO含量有明顯降低趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 月季花總黃酮對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型腦組織含水量的影響

由表4可得，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠腦組織含水量顯著升高(P<0.01)，提示造模成功。陽性藥腦絡(luò)通組可顯著降低缺血損傷后小鼠腦組織含水量(P<0.01)，月季花總黃酮各組對(duì)腦組織含水量有明顯改善作用，其中高劑量組和中劑量組可降低小鼠腦組織含水量(P<0.05)，低劑量組降低趨勢(shì)明顯，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表4。

表3 各組對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型腦組織勻漿中NO、NOS水平的影響

注：與假手術(shù)組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

表4 各組對(duì)小鼠反復(fù)腦缺血再灌注模型腦組織含水量的影響

注：與假手術(shù)組相比，##P<0.01；與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

3 討論

腦血管病(CVD)是當(dāng)今危害人類生命健康的第三主要原因，僅次于心臟病和惡性腫瘤相關(guān)疾病，根據(jù)其發(fā)病的差異性，可分為缺血性和出血性兩種[7]。劉瑛娜等[8]通過對(duì)兩種不同性質(zhì)腦卒中的發(fā)病情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，腦卒中的發(fā)病與年齡、季候有很大關(guān)系，40歲以上隨年齡增加缺血性腦卒中呈上升趨勢(shì)，夏季缺血性卒中發(fā)病率較高，但總體來說，缺血性腦卒中患病約占腦卒中的七成，如何更好的防治缺血性腦血管疾病是如今CVD研究的重點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過月季花總黃酮對(duì)小鼠反復(fù)缺血再灌注模型的作用，探討月季花總黃酮在防治腦缺血疾病的可能機(jī)制。

神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白質(zhì)，含量由高到低依次為腦、脊髓和周圍神經(jīng)節(jié)。正常情況下，細(xì)胞間質(zhì)和血液中NSE的水平非常低，在缺血缺氧后，腦組織能量代謝降低，神經(jīng)元損傷或壞死，NSE從胞內(nèi)釋放，透過血腦屏障進(jìn)入血液，使血液中NSE含量大幅上調(diào)，因此，通過檢測(cè)血清中NSE含量，能間接判斷缺血后腦組織損傷程度，可作為簡易血清生物學(xué)標(biāo)志物[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠反復(fù)缺血再灌注手術(shù)后，模型組小鼠腦組織勻漿中NSE含量大幅升高(P<0.01)，具有極顯著性，月季花各給藥組可明顯降低腦組織NSE含量，說明小鼠反復(fù)腦缺血后，月季花總黃酮對(duì)神經(jīng)元可能有保護(hù)作用，改善神經(jīng)元損傷及壞死，減少NSE從胞內(nèi)釋放，血清中含量顯著降低，其中高劑量月季花總黃酮組效果較好。

目前，腦缺血的機(jī)制大致有能量代謝障礙、自由基反應(yīng)、炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)、興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載等，而NO和NOS在腦缺血損傷中的作用和機(jī)制也越發(fā)引起關(guān)注。經(jīng)研究，NO是機(jī)體中重要的信使和效應(yīng)分子，參與機(jī)體生理病理活動(dòng)。在腦缺血發(fā)生后，根據(jù)產(chǎn)生NO細(xì)胞的類型和產(chǎn)生過程條件的不同，NO發(fā)揮保護(hù)和損傷的雙重作用[10]。

在腦缺血損傷過程中，NO和NOS主要起神經(jīng)毒性的作用。在腦缺血缺氧早期，eNOS活性上調(diào)，產(chǎn)生的NO可擴(kuò)張腦血管，增加腦組織血流量，發(fā)揮保護(hù)作用[11]，但這種保護(hù)作用僅在數(shù)小時(shí)短時(shí)間內(nèi)，隨著缺血程度的不斷加深，iNOS在中晚期大量表達(dá)，起到神經(jīng)毒性作用[12]。腦缺血后通過抑制NO和NOS，可改善腦組織的損傷以及神經(jīng)細(xì)胞凋亡[13]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，在小鼠反復(fù)腦缺血再灌注22 h后，模型組小鼠腦組織中NO、NOS水平均大幅升高(P<0.01)，產(chǎn)生的大量NO以及NOS活性上調(diào)，均會(huì)加重缺血損傷，月季花總黃酮各組具有明顯降低腦組織中NO和NOS水平的趨勢(shì)，由此可推斷，月季花總黃酮可能通過降低NO和NOS水平來減輕缺血缺氧后腦組織神經(jīng)毒性作用，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起到保護(hù)作用。

腦缺血再灌注時(shí)，產(chǎn)生大量炎癥因子和自由基，興奮性氨基酸、細(xì)胞鈣離子超載、血管活性物質(zhì)作用等均可造成腦組織水腫，腦組織含水量可反映腦水腫程度[14]，同時(shí)也可反映藥物對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用[6]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果得，與假手術(shù)組相較，模型組腦組織含水量大幅升高(P<0.01)，說明小鼠腦缺血術(shù)后組織水腫嚴(yán)重，月季花總黃酮對(duì)小鼠腦水腫有很好的改善作用，有明顯減低的趨勢(shì)，提示月季花總黃酮可通過改善腦水腫對(duì)小鼠腦缺血起到保護(hù)作用，以月季花總黃酮高劑量組效果最佳。

綜上，月季花總黃酮可以顯著降低小鼠反復(fù)再灌注模型血清中NSE含量、腦組織勻漿中NO和NOS水平、減輕缺血后腦水腫，對(duì)腦缺血起到改善作用，以高劑量效果最佳。