HPLC-DAD-ELSD法同時測定牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa的含量

楊柳，姜海，蘇曉琳，顏美玲，邢緒東，郭新月，侯阿嬌，滿文靜

(黑龍江中醫藥大學，教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040)

牛膝為莧科牛膝屬植物牛膝(AchyranthesbidentataBL.)的干燥根。根據2015版《中國藥典》記載，牛膝作為多年生草本植物，其味甘、苦、酸，性平，具有補肝腎、強筋骨、活血益陰的功效[1]。臨床應用廣泛，常用于抗炎鎮痛、腰膝骨痛、筋骨無力、抗衰老等[2]。牛膝主產于河南焦作地區(古懷慶府)，作為道地藥材，屬“四大懷藥”之一，由于種植歷史悠久、質量優良，產量較大，被《本經》認為是上品牛膝[3]。作為常用的中藥品種，牛膝的市場需求量較大，在我國河南、河北、山東、內蒙、安徽等地區均有規模化種植。本實驗樣品主要選取河南主產的部分牛膝藥材。根據化學成分研究表明，牛膝中含有甾酮、三萜皂苷和多糖等多種化學成分[4-7]。其中以齊墩果酸為苷元的三萜皂苷和甾酮類成分，可作為牛膝的主要活性成分發揮療效。2015版《中國藥典》中記載牛膝標準僅以蛻皮甾酮的含量作為質控指標，測定成分單一，難以全面評價牛膝的質量，因此本文建立了同時測定甾酮類和三萜皂苷類成分(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa) 的方法，為牛膝的綜合質量控制標準提供了實驗依據，同時也使牛膝質量的可控性得到進一步提升。以往的文獻報道了用HPLC分別測定牛膝中的甾酮類成分和皂苷類成分，樣品處理復雜且測定煩瑣[8-9]。所以本文用甲醇超聲提取法對樣品進行處理，采用HPLC-DAD-ELSD聯用法一次進樣，同時測定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的含量。建立的樣品處理過程和測定方法簡單，為多指標控制牛膝藥材質量提供了一種快速簡便的方法。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters2998二極管陣列檢測器(美國Waters公司)；Waters 2424蒸發光檢測器(美國Waters公司)；KQ-500DB型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電子天平(AL204系列中國METTLER TOLEDO電子公司)。

1.2 試劑

β-蛻皮甾酮(批號5289-74-7)、人參皂苷R0(批號34367-04-9)、竹節參皂苷Ⅳa(批號51415-02-2)標準品均購自天津西瑪科技有限公司，純度≥98%，供含量測定使用；乙腈(色譜純，Amethyst公司)；甲醇(色譜純，Amethyst公司)；甲醇(分析純，北京化工廠)；甲酸(色譜純，北京迪馬科技有限公司)；異丙醇(色譜純, Xingmake公司)。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5 TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動相：乙腈-0.08%甲酸(A)，水-2.5%異丙醇-0.08%甲酸(B)進行梯度洗脫。見表1。流速為0.9 mL/min，時間80 min。在上述條件下，牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa化合物的色譜峰與相鄰成分可達基線分離，高效液相色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫條件

注：A：HPLC-DAD檢測的對照品；B：HPLC-ELSD檢測的對照品；C：HPLC-DAD檢測的供試品；D：HPLC-ELSD檢測的供試品；1：β-蛻皮甾酮；2：人參皂苷R0；3：竹節參皂苷Ⅳa。圖1 β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa高效液相圖譜

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的對照品，各加入甲醇溶解制成適當質量濃度的對照品儲蓄液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品適量，進行粉碎，過篩，精密稱取1 g，置于具塞三角瓶中，并加入甲醇10 mL，超聲提取40 min，取上清液，濾過，為牛膝的供試品溶液。

2.4 線性關系考察

精密吸取“2.2項”下的對照品儲蓄液，配成不同濃度混合對照品溶液。按“2.1”所述方法，注入到液相色譜儀，連續進樣6次，測定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的峰面積。其中β-蛻皮甾酮以濃度(X)為橫坐標，峰面積為縱坐標(Y)，進行線性回歸計算，得到回歸方程，人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa以濃度的對數值X為橫坐標，峰面積的對數值Y為縱坐標進行線性回歸，各回歸方程呈良好的線性關系,具體見表2。結果表明，牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)分別在0.001 9～0.096 3 mg/mL、0.002 2～0.469 5 mg/mL和0.004 7～0.483 0 mg/mL濃度范圍內濃度與峰面積間呈現良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密量取牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的混合對照品溶液,在上述色譜條件下，進樣10 μL，重復進樣6次，測定供試品溶液中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa 3種化合物的峰面積, 計算RSD值結果。牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)色譜峰的RSD值(n=6)分別為0.631 %、1.427 %、0.156%。表明本法精密度較好。

表2 線性關系考察

2.6 穩定性試驗

取同一批牛膝樣品，按上述方法制備供試品溶液，分別在0、8、16、24、32、48 h進樣，在上述色譜柱條件下，測定牛膝中三種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的峰面積，計算RSD值(n=6)。結果RSD分別為2.173%、2.415%、2.003%。表明供試品溶液在48 h內基本穩定。

2.7 重現性試驗

取牛膝藥材6份，按照“2.3項”下的方法制成6份牛膝供試品溶液，按“2.1項”下色譜條件測定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的峰面積，計算RSD值(n=6)。結果牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的RSD分別為1.527%、2.230%、1.758%。結果表明,方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的牛膝藥材約0.5 g，置具塞三角瓶中，加入甲醇5 mL，共9份，精密加入β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0和竹節參皂苷Ⅳa對照品適量，以下按“2.3項”下方法操作，制備加樣回收供試品溶液。注入液相色譜儀，進樣10 μL，測定加樣回收供試品溶液中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa的含量，計算加樣回收率，結果見表3。結果表明，用本法測定樣品中3種成分的含量回收率良好。

2.9 不同批次牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa含量測定

取河南產不同批次牛膝樣品，按“2.3項”所述方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，測得牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的峰面積，通過回歸方程分別測定其含量，結果見表4。

表3 加樣回收率結果

表4 牛膝中 β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa含量

3 結論與討論

牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa因極性差異較大，使用固定的比例流動相難以同時測定出牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的含量，所以在實驗中對流動相梯度進行優化，來測定牛膝中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa的含量。結果在HPLC中3種化合物峰形基本對稱，峰與峰間可達較好的分離度。在200～400 nm范圍內對牛膝中β-蛻皮甾酮色譜峰進行紫外吸光光譜掃描，結果β-蛻皮甾酮色譜峰在248 nm處有強吸收。甾酮和皂苷作為牛膝的主要成分，由于皂苷類化合物沒有紫外吸收，且牛膝中皂苷種類繁多，只用DAD無法同時對牛膝中這兩類不同性質的化合物進行測定。而ELSD作為一種通用型檢測器，特別適用于沒有紫外吸收的皂苷類化合物的測定，所以本文將DAD和ELSD結合起來，建立了HPLC-DAD-ELSD這兩種方法結合起來同時測定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)含量。

本研究測得的河南產10個不同批次的牛膝藥材中β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa的含量分別在0.019～0.963 mg/g、0.022～4.695 mg/g和0.047～4.83 mg/g含量范圍內，所以本研究采用的HPLC-DAD-ELSD聯用法可作為牛膝定量測定方法。牛膝資源具有明顯的道地性，不同生長環境、海拔、光照、土壤性質、溫度、水分等因子單一或相互作用影響著其有效成分的積累。且同一省份不同地區牛膝中甾酮和三萜皂苷的含量存在明顯的地域差異，所以三萜皂苷可與甾酮類共同作為產地和質量鑒別的指標，為多指標控制牛膝藥材提供依據。

本研究采用HPLC-DAD-ELSD法同時測定牛膝中3種化合物(β-蛻皮甾酮、人參皂苷R0、竹節參皂苷Ⅳa)的含量，方法快捷、靈敏、簡便。可更科學、全面地對牛膝藥材的質量進行評價，并為多指標控制牛膝藥材及臨床藥用提供科學依據。