香連丸對急性潰瘍性結腸炎小鼠氧化應激介導的細胞自噬的影響研究*

韓 瑩 蔡慶宇 張 巖

（1.黑龍江中醫藥大學佳木斯學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江省佳木斯市中醫院，黑龍江 佳木斯 154002；3.佳木斯大學附屬第二醫院，黑龍江 佳木斯 154002）

自噬（Autophagy）是真核細胞內獨有的自我保護機制，是細胞利用溶酶體降解大分子物質和自身受損細胞器的一種高度保守的進化過程［1]。自1963年比利時學者克里斯汀·德·迪夫首次提出 “自噬”的概念至今，細胞自噬的研究已經成為生物醫學最熱門的領域之一［2]。在自噬過程中，細胞質的一部分被吞噬泡吞噬后形成雙膜結構自噬體，再與溶酶體融合后形成自噬溶酶體，從而降解自噬體的內容物。自噬降解后的產物可以作為細胞器和新蛋白質的合成原料，在腸上皮細胞的損傷修復和維持腸道內環境的穩態上面發揮著重要的作用［3]。

活性氧（ROS）是生物體內一類活性含氧物質和氧代謝產物的總稱，包括超氧陰離子（O2-）、羥基（OH-）和過氧化氫（H2O2）等［4]。 由 ROS 介導的氧化應激反應參與機體多個生理病理過程，是導致炎癥反應、組織損傷、細胞凋亡的重要因素之一［5]。作為潰瘍性結腸炎（UC）病理過程中的一個重要環節，過度的氧化應激反應與UC急性期腸道黏膜中性粒細胞的活化和募集密切相關［6]。因此，本研究通過采用香連丸干預葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導的急性UC模型，通過檢測氧化應激指標及自噬相關蛋白的表達，進一步明確兩者的內在關聯及香連丸的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只無特異病原（SPF）級C57BL/6小鼠，體質量（22±2）g，8周齡，購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，動物合格證批號：SCXK（黑）2015003。飼養于黑龍江中醫藥大學佳木斯學院實驗中心，飼養條件二級，恒溫恒濕，常規喂養。

1.2 試藥和儀器 1）試藥：美沙拉嗪緩釋顆粒（法國愛的發制藥集團，國藥準字：H20143164，500 mg/袋），配制成美沙拉嗪混懸液。香連丸（李時珍醫藥集團有限公司，國藥準字：Z42020426，主要成分：萸黃連、木香，6 g/袋），藥物經研磨后配制成香連丸混懸液；DSS購于上海翊圣生物科技有限公司；丙二醛（MDA）含量試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）活力檢測分析試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；兔抗大鼠Beclin-1、LC3II、LC3I和p62單克隆抗體購于英國Viva Bioscience公司；兔抗大鼠β-actin、HRP標記山羊抗兔IgG和高敏ECL化學發光試劑盒購于沈陽萬類生物科技公司。2）儀器：光學顯微鏡購于日本Olympus公司；電泳儀、電泳槽和凝膠成像分析系統均購于北京六一生物科技有限公司。

1.3 分組與造模 采用隨機數發生器，將C57BL/6小鼠隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組、香連丸低劑量組、香連丸中劑量組和香連丸高劑量組，每組10只。除空白組外，余下各組均參照文獻［7]中方法復制急性UC模型。具體方法如下：5%DSS溶液連續飲用7 d，改為蒸餾水連續飲用10 d，每隔1 d更換一次新鮮配制DSS溶液。空白組小鼠給予蒸餾水連續飲用15 d。

1.4 藥物干預 造模期間，根據人-小鼠體表面積比例換算。美沙拉嗪組給予美沙拉嗪混懸液20 mg/（kg·d）灌胃治療，香連丸用藥劑量參照文獻［8]中用量，低、中、高劑量組分別給予香連丸混懸液 1.6、3.2、6.4 g/（kg·d）灌胃治療，空白組和模型組則給予0.001 mL/kg的蒸餾水灌胃，連續灌胃給藥15 d。

1.5 標本采集 各組小鼠于造模開始之日每日稱重，并觀察大便性狀及便血情況。于末次給藥結束后，禁食不禁水12 h，采用10%水合氯醛腹腔麻醉后，收集回盲部至肛緣的結腸組織，用于檢測。

1.6 觀察項目 1）疾病活動指數：疾病活動指數（DAI）評分參照文獻［9]，具體如下：根據體質量的減少量（＜1%，1%～5%，5%～10%，10%～15%和＞15%）分別計 0、1、2、3、4 分，大便性狀（正常、軟便、便溏）和便血情況（潛血陰性、潛血陽性和肉眼血便）分別計0、2、4分，總分0～12分，分值越高，病情越重。2）結腸組織病學觀察：處死小鼠后取一部分結腸組織，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，常規HE染色。并根據參考文獻［10]中標準，對結腸組織進行組織學損傷評分。該評分從潰瘍分級、病變深度、炎癥、纖維化和肉芽組織5個方面進行評分，總分0～10分，分值越高，病情越重。3）MDA的表達和SOD、GSH-px的活性檢測：取部分結腸組織，加抽提緩沖液，4℃電動勻漿，15 000 r/min離心20 min，取上清液，采用生化法測定MDA的表達和SOD、GSH-px的活性。具體實驗方法參照試劑盒說明書。4）Western blotting法檢測結腸組織中自噬相關蛋白表達：取部分結腸組織，RIPA裂解，均漿，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，SDS-PAGE電泳、轉膜，封閉。 加入 Beclin-1（1∶1 000）、LC3II（1∶1 000）、LC3I（1∶1 000）、p62（1∶1 000）和 β-actin（1∶500）一抗，孵育過夜12 h。緩沖液洗滌，加入HRP標記的二抗HRP標記山羊抗兔IgG，洗滌，ECL發光，顯影，凝膠成像系統拍照，Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以β-actin為內參，計算各蛋白的相對表達度。

1.7 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

圖1 各組小鼠結腸組織病理學觀察（HE染色，200倍）

2.1 各組小鼠結腸組織病理學觀察 見圖1。正常組小鼠結腸黏膜結構清晰，杯狀細胞豐富，腺體排列規整；模型組黏膜結構紊亂，杯狀細胞減少，腺體破壞伴有大量炎性細胞的浸潤。各治療組小鼠結腸黏膜損傷較模型組均有不同程度的改善，杯狀細胞增加，腺體破壞減輕，炎性細胞減少，其中以香連丸高劑量組改善最佳。

2.2 各組小鼠DAI及組織學損傷評分比較 見表1。造模后，模型組小鼠DAI及組織學損傷評分顯著增高，與空白組比較差異均具有顯著統計學意義（P＜0.01）；美沙拉嗪組及香連丸各劑量組小鼠DAI及組織學損傷評分均顯著降低，與模型組比較差異均具有顯著統計學意義（P＜0.01）。

表1 各組小鼠DAI及組織學損傷評分的比較（分，±s）

表1 各組小鼠DAI及組織學損傷評分的比較（分，±s）

與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同

組 別 n DAI 組織學損傷評分空白組 10 0.80±1.03 0.40±0.52模型組 10 9.20±1.69** 6.50±2.27**美沙拉嗪組 10 4.10±1.79△△ 3.00±2.21△△香連丸低劑量組 10 7.00±1.89△△ 4.20±2.20△△香連丸中劑量組 10 5.00±1.15△△ 3.80±1.32△△香連丸高劑量組 10 3.80±1.23△△ 1.50±1.08△△

2.3 各組小鼠結腸組織中氧化應激指標比較 見表2。造模后，模型組小鼠結腸組織中MDA的表達顯著增加，SOD及GSH-px的活性顯著降低，與空白組比較差異均具有顯著統計學意義（P＜0.01）；美沙拉嗪組及香連丸各劑量組均能顯著減少結腸組織中MDA的表達，增加SOD及GSH-px的活性，與模型組比較差異均具有統計學意義（P＜0.05和P＜0.01）。香連丸各劑量組中，以香連丸高劑量組療效最佳。

表2 各組結腸組織中氧化應激指標的比較（±s）

表2 各組結腸組織中氧化應激指標的比較（±s）

組 別 n MDA（mmol/mg）空白組 10 10.06±1.86模型組 10 38.74±6.86**美沙拉嗪組 10 19.93±4.24△△香連丸低劑量組 10 30.18±5.33△△香連丸中劑量組 10 26.62±3.28△△香連丸高劑量組 10 16.40±3.09△△SOD（U/mg） GSH-px（U/g）53.82±9.79 199.35±15.20 19.73±3.53** 125.69±8.35**41.28±5.03△△ 164.19±7.24△△24.83±3.80△ 137.18±9.45△29.93±4.68△△ 138.60±13.05△△43.06±5.67△△ 162.49±8.33△△

2.4 各組小鼠結腸組織中自噬相關蛋白表達的比較見表3，圖2。造模后，模型組小鼠結腸組織中Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表達及LC3Ⅱ/LC3I的比值顯著降低，LC3Ⅰ蛋白的表達顯著增加，與空白組比較差異均具有顯著統計學意義（P＜0.01）；美沙拉嗪組及香連丸各劑量組均能上調Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下調LC3I蛋白的表達，與模型組比較差異均具有統計學意義 （P＜0.05和P＜0.01）。

表3 各組結腸組織中自噬相關蛋白表達的比較（±s）

表3 各組結腸組織中自噬相關蛋白表達的比較（±s）

組 別 n空白組 10模型組 10美沙拉嗪組 10香連丸低劑量組 10香連丸中劑量組 10香連丸高劑量組 10 Beclin-1/β-actin 1.00±0.10 0.27±0.07**0.75±0.14△△0.49±0.06△△0.66±0.09△△0.87±0.14△△LC3Ⅰ/β-actin LC3II/β-actin 0.82±0.14 1.15±0.27 1.62±0.37** 0.51±0.07**1.21±0.27△△ 1.86±0.36△△1.36±0.25△ 0.79±0.11△1.17±0.18△△ 1.01±0.22△△0.92±0.18△△ 3.42±0.72△△LC3Ⅱ/LC3Ⅰ p62/β-actin 1.41±0.34 0.95±0.18 0.28±0.07**0.40±0.10**1.55±0.58△△ 0.90±0.14△△0.58±0.16 0.57±0.08△△0.87±0.11△ 0.69±0.14△△3.77±1.24△△ 1.19±0.21△△

圖2 各組小鼠結腸組織中自噬相關蛋白的表達

3 結 論

氧化應激指體內在受到各種有害刺激的情況下，抗氧化和氧化作用的失衡，活性氮簇和反應性氧化物消除減少、生成過多，從而引起組織損傷的一個重要病理過程［11]。同時，作為炎癥反應的一個病理過程，氧化應激與炎性因子相互促進，炎性能夠通過氧化作用使氧化應激反應擴大化，而氧化應激又能誘導炎性因子的大量釋放［12]。MDA作為組織氧化損傷的指示劑，是脂質過氧化物的分解產物，能夠引起細胞膜結構和DNA的破壞、蛋白質的交聯和變性［13]。SOD和GSH-Px作為重要的過氧化物分解酶，能夠有效地清除體內的氧自由基，抑制腸道組織脂質過氧化反應，從而起到保護結腸組織屏障的功能［14]。

研究證實，氧化應激反應和自噬之間存在著復雜的關聯，活性氧能夠通過一系列途徑參與細胞自噬過程，并通過降解各種被氧化的蛋白以減輕氧化應激引起的細胞損傷。Beclin-1是哺乳動物參與自噬的特異性基因，通過與PI3K形成復合體參與ATG蛋白在自噬前體中的定位，并通過促進自噬小泡的成核和招募細胞溶質中的蛋白調節自噬的活性。作為自噬體膜上的標記蛋白，LC3通常以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ的形式存在于細胞內。自噬體形成后，散在分布于細胞質中的LC3Ⅰ通過偶聯磷酸酰乙醇胺形成LC3Ⅱ，并定位于自噬體的內膜和外膜上，直至與溶酶體融合，因此LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值在一定程度上反映了機體的自噬水平［15-18]。

本研究中我們發現，香連丸能夠顯著改善由DSS誘導的小鼠結腸組織形態，降低DAI及組織學損傷評分。同時香連丸通過減少結腸組織中MDA的表達，增加SOD及GSH-px的活性，增加組織抗氧化的能力，減輕氧化應激反應引起的黏膜損傷。在自噬水平，我們發現伴隨著UC小鼠氧化應激反應的增加，其自噬水平受到抑制，而香連丸各劑量均能上調Beclin-1、LC3Ⅱ、p62蛋白的表達及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值，下調LC3Ⅰ蛋白的表達，誘導細胞發生自噬，從而減輕組織損傷。

綜上所述，我們認為香連丸在治療UC方面具有顯著的療效，能夠顯著改善結腸組織損傷，其作用機制可能是通過降低氧化應激反應和促進細胞自噬實現的。