4種硝基呋喃代謝物復合熒光免疫層析試紙條的制備

郭會燦

摘 要：為建立一種基于量子點熒光免疫層析技術快速檢測4 種硝基呋喃類代謝物的方法，采用N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC）法合成4 種硝基呋喃類代謝物的人工抗原，并融合制備對應的單克隆抗體，通過EDC-NHS一步法將量子點微球（quantum dot submicrobeads，QBs）分別與3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ）、1-氨基-2-乙內酰（1-aminohydantoin，AHD）和氨基脲（semicarbazid，SEM）偶聯，得到相應的QBs探針，在此基礎上制備復合熒光免疫層析試紙條。結果表明：AOZ、AHD、SEM和AMOZ的檢出限分別為0.4、0.4、0.5、0.5 μg/L;通過加標回收實驗對批內和批間的重復性和準確度進行評價，得出該試紙條的批內檢測回收率為80%～110%，批內變異系數在15%以內，批間回收率為80%～100%，批間變異系數在15%以內;且AOZ、AHD、SEM和AMOZ之間的交叉反應率小于0.1%，說明成功將熒光免疫層析技術和多元檢測技術相結合，應用于同時檢測4 種硝基呋喃類代謝物，且試紙條的靈敏度和準確性高、特異性好。

關鍵詞：硝基呋喃代謝物;熒光免疫層析;免疫抗原;量子點微球

Abstract： This research was done in order to establish a rapid quantum dot （QD）-based immunochromatographic assay （ICA） for the simultaneous detection of four nitrofuran metabolites （3-amino-2-oxazolidinone （AOZ）， 5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone （AMOZ）， 1-aminohydantoin （AHD） and semicarbazid （SEM））. Immunogens were synthesized by N-hydroxysuccinimide （NHS）/ 1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl） carbodiimide hydrochloride （EDC） method， and monoclonal antibodies were prepared by cell fusion. QD microspheres were coupled with AOZ， AHD， SEM and AMOZ， respectively by one-step method using EDC and NHS to obtain quantum dot submicrobeads （QBs） probes. On this basis， a fluorescent immunochromatographic strip was prepared. The results showed that the detection limits of this test strip for AOZ， AHD， SEM and AMOZ were 0.4， 0.4， 0.5 and 0.5 μg/L， respectively. The repeatability and accuracy within and between batches were evaluated by spiked recovery experiments， and the results showed that the recovery rates were 80%–110% and 80%–100% with coefficient of variations of less than 15% for intra- and inter-batch assays， respectively. The cross-reactivity among AOZ， AHD， SEM and AMOZ was less than 0.1%. In conclusion， the combination of fluorescent immunochromatography and multivariate detection technique can be successfully applied to simultaneously detect four nitrofuran metabolites with high sensitivity， accuracy and specificity.

Keywords： nitrofuran metabolites; fluorescent immunochromatography; immunogen; quantum dot microspheres

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20190322-065

中圖分類號：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2019）04-0029-07

硝基呋喃類抗生素作為一類由人工合成、具有5-硝基特定結構的廣譜抗菌類藥物，被廣泛應用在畜禽胃腸道疾病的治療[1]，或者作為飼料添加劑使用。硝基呋喃類抗生素主要包括呋喃唑酮（Furazolidone）、呋喃西林（Nitrofurazone）、呋喃它酮（Furaltadone）及呋喃妥因（Nitrofurantoin）等，此類藥物也是一類具有潛在致癌性和能夠誘導突變的物質[2]。歐盟于1995年發布了一項關于禁止使用呋喃類抗菌物質的指令，規定不得在動物源性食品中檢出呋喃類物質。我國農業部第235號公告[3]中列出的禁止使用藥物清單中包括呋喃它酮和呋喃唑酮，且規定在動物性食品中不得檢出。硝基呋喃類藥物在機體內代謝速度很快且半衰期短、僅持續數小時的特點，造成了檢測機體內硝基呋喃類藥物相當困難。呋喃唑酮的代謝物為3-氨基-2-惡唑烷酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ），呋喃它酮的代謝物為5-甲基嗎啉-3-氨基-2-唑烷基酮（5-morpholine-methyl-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ），呋喃妥因的代謝物為1-氨基-2-乙內酰（1-aminohydantoin，AHD），呋喃西林的代謝物為氨基脲（semicarbazid，SEM），以上代謝產物能夠與機體的組織蛋白質反應，形成穩定的蛋白質結合物，在機體內殘留很長時間，其代謝物則通過水解反應從蛋白質中游離出來。因此，硝基呋喃類藥物的真實殘留狀況由檢測得到的其代謝物的含量來體現。同時，檢測硝基呋喃類藥物的代謝產物對硝基呋喃類藥物的殘留起到監控作用。目前，歐盟對硝基呋喃類代謝物的檢測方法靈敏度做出了規定，要求檢測方法靈敏度為1 μg/kg。我國目前采用國家標準GB/T 21311—2007《動物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測方法 高效液相色譜/串聯質譜法》[4]，此方法的SEM、AOZ、AMOZ和AHD檢出限（limits of detection，LOD）均為0.5 μg/kg。

硝基呋喃類代謝物殘留的檢測方法多種多樣，儀器法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[5-6]、液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[7-9]、液相色譜-質譜（liquid chromatography- mass spectrometry，LC-MS）法和分光光度法，免疫法主要有酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法[10-11]、免疫層析技術等。儀器法的優點是自動化程度高、精確度高、假陽性率低，缺點是價格昂貴、成本高、操作繁瑣、樣品處理復雜、需要專業分析人員。ELISA法雖然具有快速、簡便、靈敏、高特異性的特點，但其缺點是易出現假陽性結果。近年來，免疫層析技術成為熱門檢測技術，主要包括以膠體金、熒光、磁珠為基礎的免疫層析技術，研究比較多的是膠體金免疫層析技術，以膠體金為示蹤物標記抗原或抗體，用于半定量或定性檢測，此方法靈敏度不高，在針對心血管標志物、腫標等對靈敏度有高要求的領域受限。柳愛春等[12]研制的4 種硝基呋喃代謝物快速膠體金檢測試紙條的LOD分別為AOZ 0.5 μg/kg、SEM 1.0 μg/kg、AMOZ 1.0 μg/kg、AHD 2.0 μg/kg，肉眼觀察結果只能做到半定量檢測。免疫磁珠層析技術以磁性微球與抗原或抗體特異性結合，靠外界磁場產生定向移動，通過檢測磁信號代替光信號，優點是敏感性高，缺點是價格昂貴、技術復雜、工藝實施難度高，目前尚無研究報道將此項技術應用到硝基呋喃類代謝物的檢測中。熒光免疫層析技術又分為量子點（quantum dots，QDs）層析技術和上傳發光技術。上傳發光技術以鑭系元素摻雜入陶瓷顆粒，構成上轉化顆粒（upconversion particle，UCP），作為標記物實現免疫層析，優點是安全、穩定、靈敏，缺點是價格昂貴、工藝要求高。袁建等[13]利用銪（Ⅲ）元素的納米粒子標記抗體建立快速檢測4 種硝基呋喃代謝物的免疫層析法，此方法用肉眼觀察只能達到半定量檢測，4 種代謝物的LOD分別為CPSEM（CP（羧基苯甲醛）與SEM的衍生物））0.5 ng/g、CPAMOZ（CP與AMOZ的衍生物））0.5 ng/g、CPAHD（CP與AHD的衍生物）0.1 ng/g、CPAOZ（CP與AOZ的衍生物）0.5 ng/g，同時該免疫層析法是試紙條和微量滴定孔組合的形式，在加樣時比較繁瑣，需要人工吸取4 種銪（Eu）納米球標記抗體及待檢樣品，一起加入到微量滴定孔進行反應，很容易造成人為誤差，且操作繁瑣、重復性差。量子點熒光層析技術以主族Ⅱ～Ⅵ（如CdSe）、Ⅲ～Ⅴ（InAs、GaSe、InP）元素構成熒光探針標記物，通過能量躍遷可以發出多種不同顏色的光，很適合作為多組分檢測的標記物，再加上準確性好、靈敏度高、檢測時間短、成本低，被廣泛用于食品、醫藥、獸藥等行業，成為熱門研究方向[14]。

本研究以量子點熒光免疫層析技術為基礎，建立4 種硝基呋喃代謝物殘留的復合熒光免疫分析技術，通過性能測試對試紙條進行全面評價，對該多元熒光免疫層析檢測技術在獸藥殘留領域的廣泛應用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BALB/c小鼠購自河北醫科大學。

AOZ、AMOZ、1-氨基-乙內酰脲鹽酸鹽（1-aminohydantoin hydrochloride，AHD·HCl）、鹽酸氨基脲（semicarbazide hydrochloride，SEM·HCl）（純度≥99.0%）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國Sigma公司;量子點熒光微球

美國Ocean NanoTech公司;N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylformamide，DMF）、無水甲醇? ?天津永大化學試劑有限公司;鄰醛基苯甲酸（2-carboxybenzaldehyde，2-CBA）、對醛基苯甲酸（4-carboxybenzaldehyde，4-CBA） 阿拉丁試劑（上海）有限公司;N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 南京化學試劑股份有限公司;1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethylaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDC） 上海思域化工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

RF-6000熒光分光光度計 日本島津公司、NanoDrop 2000紫外掃描儀、Micro17超速離心機 美國Thermo公司;CR-GIII高速離心機 日本Hitachi公司;MiLLi-QingegraLLo超純水系統 德國密理博公司;JA3003電子精密天平 上海衡平儀器儀表廠;T-Meter I熒光免疫分析儀 河北特溫特生物科技發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫抗原的制備

半抗原的合成[15]：以CPAOZ為例，合成半抗原。將0.4 g 4-CBA用2 mL純水溶解，緩緩加DMF至上述溶液，邊滴加邊攪拌，直至4-CBA完全溶解;稱取0.5 g AOZ緩慢傾入上述反應液中，室溫反應5 h，3 000 r/min離心，保留沉淀棄上清液，沉淀為淡黃色，再加入0.01 mol/L?PBS重懸沉淀，洗滌3 次，50 ℃烘干，得半抗原CPAOZ。同理，用AMOZ、AHD·HCl和SEM·HCl置換上述步驟中的AOZ，即可得到半抗原CPAMOZ、CPAHD和CPSEM。

免疫抗原的合成[16]：稱取24 mg的CPAOZ，用2 mL DMF溶解，緩慢加入溶有18 mg NHS的PBS緩沖液，充分攪拌，反應5 min;緩慢加入溶有40 mg EDC的PBS緩沖液，室溫攪拌2 h;稱取60 mg BSA溶于2 mL PBS中，然后將上述反應溶液緩慢加入，4 ℃攪拌反應過夜;0.01 mol/L PBS透析3 d，-20 ℃保存備用。AOZ抗原合成路線圖如圖1所示。檢測原同法制備。

1.3.2 量子點熒光微球（quantum dot submicrobeads，QBs）標記抗體

采用EDC-NHS一步法[17]將QBs分別與4 種硝基呋喃類代謝物偶聯[18]：將1 mg QBs用5 mL磷酸（PB）緩沖液（含0.5% 吐溫-20、0.01 mol/L、pH值為6.0）進行懸浮，10 000 r/min離心30 min，收集沉淀;沉淀用5 mL PB緩沖液溶解后，加入1.0 μg EDC和0.8 μg NHS，混勻后避光反應1 h，將100 μg抗體加入到混合液中，混合攪拌3 h，再加入0.1 mL 0.3 mol/L的甘氨酸封閉2 h，10 000 r/min離心30 min，收集沉淀;沉淀用750 μL復溶液（含5%蔗糖、5% BSA、2% 吐溫-20和1% ProClin的PB緩沖液）復溶，4 ℃保存備用。

1.3.3 QBs標記抗體偶聯物的表征

通過熒光分光光度計測定QBs（8 pmol/L）[19]，光電倍增管電壓為700 V，響應時間為0.5 s，激發波長為350 nm，發射起始波長為500～650 nm，發射狹縫與激發狹縫均為5 nm，掃描速率為240 nm/min。

1.3.4 偶聯pH值的優化

在1.3.2節QBs標記抗體過程中，分別選用pH值為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的0.01 mol/L PB緩沖液[20]。用標記好的抗體測試試紙條，檢測不同標記pH值條件下的熒光強度變化，每個pH值重復檢測5 次，確定最佳標記pH值。

1.3.5 飽和標記量的優化

在1.3.2節QBs標記抗體過程中，保持QBs的量不變，分別加入25、50、100、125、150、200、300 μg的抗體進行偶聯，測定方法同1.3.4節，結果采用Sigmaplot軟件繪制曲線圖，橫坐標為抗體飽和標記量，縱坐標為T線熒光強度，確定最佳飽和標記量。

1.3.6 試紙條的組成

QBs熒光免疫層析試紙條的組成如圖2所示，其中QBs探針包被在結合墊上[21-22]，AOZ抗原、AMOZ抗原、AHD抗原和SEM抗原分別作為T線，羊抗兔二抗作為C線，依次噴涂在NC膜上。

1.3.7 樣品預處理

1）衍生[23]：稱取5.0 g魚肉樣品，加入10 mL HCl溶液（1 mol/L），進行均質處理后放入50 mL離心管中，加入500 μL鄰硝基苯甲醛溶液（30 mmol/L），50 ℃混勻反應60 min;

2）萃取[24]：將上述反應溶液用1 mol/L的NaOH調至pH 7.0，加入10 mL乙酸乙酯，渦旋萃取1 min，8 000 r/min離心20 min，留取乙酸乙酯層，60 ℃氮氣吹干;用1 mL正己烷復溶，加入1 mL 0.1 mol/L的PBS緩沖液進行萃取，8 000 r/min離心20 min，留取緩沖液層用于檢測。

1.3.8 試紙條性能測試

1.3.8.1 標準曲線的制作及檢測限測定

分別制備4 種硝基呋喃代謝物的系列標準溶液，以AOZ為例，將1 mg/mL的AOZ母液稀釋成系列標準溶液（質量濃度分別為0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00 μg/L），進行QBs熒光免疫層析試紙條測試，每個質量濃度測定5 個平行，用干式熒光分析儀進行檢測，并讀取數值。設定質量濃度為0 μg/L時的標準溶液FIT/FIC比值為B0，其他加標質量濃度的FIT/FIC比值為B，以B/B0×100為縱坐標，質量濃度為橫坐標作圖，繪制競爭抑制曲線，確定定量范圍、抑制率半抑制質量濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）及檢測限IC10[25]。

1.3.8.2 準確度和精密度實驗

通過魚肉樣本添加回收實驗檢測QBs熒光免疫層析試紙條的準確度和精密度[26-28]，在空白魚肉組織中添加0.5、2.0、4.0 μg/L 3 個質量濃度的4 種硝基呋喃代謝物，按照1.3.7節的方法進行樣品預處理，每個質量濃度重復測定5 次，共測定3 個批次，計算加標回收率、批內變異系數和批間變異系數。

1.3.8.3 特異性實驗

分別測試其中1 種硝基呋喃代謝物與其他3 種代謝物的交叉反應性，將4 種硝基呋喃代謝物分別配制成0.5、10.0、100.0 μg/L的標準溶液，用熒光免疫層析試紙條進行測試，用干式熒光分析儀進行結果判讀。

1.3.8.4 與LC-MS/MS法的對比實驗

為驗證本研究中量子點復合熒光免疫層析試紙條在魚肉樣本檢測中的可用性，對來自石家莊市獸藥監察所的5 份已知樣品分別用自制試紙條和GB/T 21311—2007中描述的LC-MS/MS法（樣品前處理和檢測方法）進行檢測。

1.4 數據處理

采用SPSS統計軟件進行數據處理，Origin制圖軟件繪制標準曲線。

2 結果與分析

2.1 人工合成抗原的紫外掃描鑒定結果

由圖3可知，BSA的最大吸收峰在280 nm波長處，CPAOZ的最大吸收峰在330 nm波長處，BSA和CPAOZ偶聯后，在波長280 nm和330 nm處均疊加出現吸收峰，表明偶聯成功。根據朗伯-比爾定律，計算出CPAOZ-BSA的分子結合比為15∶1。同理，CPSEM-BSA、CPAHD-BSA和CPAMOZ-BSA的紫外掃描圖如圖4～6所示，均表明偶聯成功，CPSEM-BSA分子結合比為13.5∶1、CPAHD-BSA分子結合比為19.7∶1、CPAMOZ-BSA分子結合比為19.6∶1。

2.2 偶聯pH值的確定

pH值會影響偶聯過程中抗體的生物活性，通過評價pH值對熒光免疫層析試紙條檢測FIT、FIC、FIT/FIC值和競爭抑制率的影響，確定最佳偶聯pH值[29]。由圖7可知，pH值對熒光免疫層析試紙條的FIT/FIC值影響不大，但是對FIT、FIC和競爭抑制率有較大影響。當pH值為6.5時，試紙條C線、T線熒光強度最高，且競爭抑制率最好，達69%。因此，選擇pH值為6.5的緩沖液作為偶聯緩沖液。

2.3 飽和標記量的確定

將1 mg QBs與不同量的抗體進行偶聯，檢測陰性樣本試紙條T線的熒光強度變化[30]。由圖8可知，T線的熒光強度隨抗體飽和標記量的增加而增強，在100 μg時強度趨于穩定。因此確定100 μg/mg是最佳抗體飽和標記量。

2.4 熒光免疫層析試紙條的性能測試

2.4.1 標準曲線的建立

為了減少基質效應，本研究采用魚肉組織陰性樣本添加系列標準品，繪制QBs熒光免疫層析試紙條定量標準曲線。得到CPAOZ的線性范圍為0.1～5.0 μg/L，線性方程為y=1.783 1x+2.115 1（R?=0.997 7），IC50為1.54 μg/L，IC10為0.4 μg/L;CPAHD的線性范圍為0.1～5.0 μg/L，線性方程為y=1.675 0x+1.968 8（R2=0.994 7），IC50為1.4 μg/L，IC10為0.4 μg/L;CPSEM的線性范圍為0.1～5.0 μg/L，線性方程為y=1.906 6x+2.323 6（R?=0.996 1），IC50為1.75 μg/L，IC10為0.5 μg/L;CPAMOZ的線性范圍為0.1～5.0 μg/L，線性方程為y=1.995 9x+2.442 1（R?=0.998 0），IC50為1.87 μg/L，IC10為0.5 μg/L。通過計算IC10得出的AOZ、AHD、SEM和AMOZ的方法檢出限分別為0.4、0.4、0.5、0.5 μg/L。

2.4.2 準確度及精密度

通過加標回收實驗對批內和批間重復性和準確度進行評價。由表1可知，該QBs熒光免疫層析試紙條的批內檢測回收率為80%～110%，批內變異系數在15%以內，批間回收率為80%～100%，批間變異系數在15%以內，表明該試紙條具有較好的精密度和準確度，符合《食品中獸藥殘留檢測指南》規定的獸藥殘留檢測方法的回收率為80%～120%、變異系數在15%以內的要求。

2.4.3 特異性

用QBs熒光免疫層析試紙條分別測試4 種代謝物的系列標準溶液，結果表明，某1 種硝基呋喃代謝物對其他代謝物的測試未出現陽性結果，4 種硝基呋喃代謝物AOZ、AHD、SEM和AMOZ之間的交叉反應率小于0.1%，表明試紙條具有較好的特異性[31-32]。

2.4.4 與LC-MS/MS法的比較結果

為驗證試紙條能夠滿足實際樣品檢測的要求，將其與GB/T 21311—2007中描述的LC-MS/MS儀器法進行對比。由表2可知，QBs熒光免疫層析試紙條與LC-MS/MS法的檢測結果有很好的相關性，2 種方法均檢出2 份陰性樣本，分別為樣品1和樣品5，檢出3 份陽性樣本，分別為樣品2～4，2 次重復測定結果一致。上述結果證明，自制的QBs熒光免疫層析試紙條可以滿足實際樣品的檢測要求。

3 討 論

免疫層析技術由于其檢測周期短、成本低、配套儀器簡單，已經在食品安全、獸藥殘留、生物醫藥等行業廣泛應用，但其檢測靈敏度相對于儀器法（電化學傳感、色譜技術、微陣列技術）較低。目前，主要研究從以下幾個方面提高方法的靈敏度：1）選用高特異、高親和性的抗體，在處理過程中采取適當的保護措施，減少生物活性的損失，從而提高方法自身的檢測靈敏度;

2）改進層析的方法，去掉結合墊，處理樣品墊，使其具有良好的穩定性和釋放性，同時可以增加待檢樣本與標記抗體在液相中的反應時間，使反應更充分，提高競爭效率，從而提高方法的檢測靈敏度;3）選用新型可替代、超靈敏的標記物，目前大眾所熟知的標記物質有膠體金顆粒、彩色乳膠微球，近年新發展起來的量子點、量子點微球，由于其獨特的光學特性及高強度的發射光譜特性，逐漸作為新標記物被應用。QBs是將量子點熒光染料通過包埋或吸附的方式固定在高聚物載體上，在高聚物載體的殼結構下性質穩定，不易發生聚沉和猝滅。Xiang等[33]構建載體包埋量子點染料，形成熒光微球，并成功利用電化學方法對尿道病原菌進行了檢測，其研制的量子點熒光微球的檢測靈敏度比市售的商業化標記物高出10多倍。

多元檢測體系是研究者為了提高檢測效率，節約成本，而將多種物質在同一試紙條上進行檢測，且相互之間互不干擾，對多種待測物含量相關性的研究意義深遠。Song Suquan等[34]實現了在同一膠體金試紙條上同時檢測玉米中的嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1，肉眼觀察到的LOD分別為1、50、60 μg/kg，儀器讀取的LOD為0.05、1.00、3.00 μg/kg。李丹妮等[35]制備的熒光免疫層析定量試紙條同時檢測克倫特羅、萊克多巴胺和沙丁胺醇3 種瘦肉精物質的LOD分別可達0.2、0.4、0.5 μg/L，且與其他同類藥物交叉反應率很低，具有良好的特異性。

4 結 論

通過EDC-NHS一步法將QBs分別與AOZ、AHD、SEM和AMOZ偶聯，得到相應的QBs探針，在此基礎上結合多元檢測體系和QBs熒光免疫檢測層析技術，制備硝基呋喃代謝物復合熒光免疫層析試紙條。通過繪制標準曲線，得出AOZ、AHD、SEM和AMOZ的LOD分別為0.4、0.4、0.5、0.5 μg/L;通過加標回收實驗對批內和批間的重復性和準確度進行評價，得出試紙條的批內檢測回收率為80%～110%，批內變異系數在15%以內，批間回收率為80%～100%，批間變異系數在15%以內;且4 種硝基呋喃代謝物AOZ、AHD、SEM和AMOZ之間的交叉反應率小于0.1%。

參考文獻：

[1] 李軍， 張會彩， 劉聚祥， 等. 酶聯免疫吸附檢測動物飼料中呋喃唑酮[J]. 中國獸醫雜志， 2009， 45（8）： 85-87. DOI：10.3969/j.issn.0529-6005.2009.08.034.

[2] 蔣宏偉. 酶聯免疫技術在動物產品中硝基呋喃類藥物殘留檢測的應用[J]. 陜西農業科學， 2006（5）： 53-55.

[3] 農業部. 中華人民共和國農業部公告第235號[EB/OL]. （2002-10-24） [2019-03-20]. https：//www.docin.com/p-1666487561.html.

[4] 中華人民共和國質量監督檢驗檢疫總局， 中國國家標準化管理委員會. 動物源性食品中硝基呋喃藥物代謝物殘留檢測方法 高效液相色譜/串聯質譜法： GB/T 21311—2007[S]. 北京： 中國標準出版社， 2007.

[5] 于慧娟， 蔡友瓊， 畢士川， 等. 高效液相色譜法測定水產品中呋喃唑酮的殘留量[J]. 色譜， 2005， 23（1）： 114-117. DOI：10.3321/j.issn：1000-8713.2005.01.031.

[6] 農業部. 中華人民共和國農業部1077號公告-2-2008[EB/OL]. （2008-8-11）?[2019-03-20]. http：//bbs.foodmate.net/thread-301120-1-902.html.

[7] 彭濤， 邱月明， 李淑娟， 等. 高效液相色譜-串聯質譜法測定動物肌肉中硝基呋喃類抗生素代謝物[J]. 檢驗檢疫科學， 2003， 13（6）： 23-28. DOI：10.3969/j.issn.1674-5354.2003.06.007.

[8] 王麗娜， 劉凱， 杜柏林， 等. UPLC/MS/MS測定動物尿液中9 種β-受體激動劑殘留量[J]. 現代畜牧獸醫， 2013（8）： 42-46. DOI：10.3969/j.issn.1672-9692.2013.08.018.

[9] 農業部. 中華人民共和國農業部781號公告-4-2006[EB/OL]. （2006-12-16）?[2019-03-20]. http：//down.foodmate.net/standard/sort/3/17156.html.

[10] 宋麗麗， 張曉輝， 張海琪， 等. 酶聯免疫法快速測定水產品中呋喃唑酮、呋喃它酮代謝物[J]. 浙江農業學報， 2008， 20（4）： 296-299.

[11] 農業部. 中華人民共和國農業部1025號公告-17-2008[EB/OL]. （2008-04-29） [2019-03-20]. http：//down.foodmate.net/standard/sort/9/19354.html.

[12] 柳愛春， 劉超， 桑麗雅， 等. 硝基呋喃類代謝物抗原合成及在膠體金試紙條上的應用[J]. 現代農業科技， 2012（23）： 265-267. DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2012.23.171.

[13] 袁建， 董雪， 邢常瑞， 等. 一種快速檢測四種硝基呋喃代謝物的免疫層析法： 中國， CN 109239328 A[P]. 2019-01-18.

[14] 祝偉霞， 劉亞風， 梁偉， 等. 動物性食品中硝基呋喃類藥物殘留檢測研究進展[J]. 動物醫學進展， 2010， 31（2）： 99-102. DOI：10.3969/j.issn.1007-5038.2010.02.023.

[15] 趙亦靜， 傅小偉， 張明洲， 等. 呋喃西林免疫抗原的合成與鑒定[J]. 現代農業科技， 2008（14）： 197-199. DOI：10.3969/j.issn.1007-5739.2008.14.151.

[16] 任海濤， 沈玉棟， 徐振林， 等. 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體制備及酶聯免疫吸附分析方法[J]. 分析化學， 2012， 40（5）： 745-751. DOI：10.3724/SP.J.1096.2012.10409.

[17] 丁橋棋， 李麗， 范文韜， 等. 基于新型量子點熒光微球的氯霉素免疫層析試紙條的制備和應用[J]. 分析化學研究報告， 2017， 45（11）： 1686-1693. DOI：10.11895/j.issn.0253-3820.170300.

[18] 解泉源， 賴衛華， 劉春梅， 等. 大腸桿菌O157：H7熒光微球免疫層析試紙條的研制[J]. 食品科學， 2013， 34（16）： 353-357. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201316072.

[19] 唐海波， 齊維， 唐詩幸， 等. 熒光定量快速檢測鮮奶中四環素總量殘留[J]. 現代食品科技， 2012， 28（11）： 1600-1602.

[20] 郭詩靜， 唐海波， 齊維， 等. 免疫熒光層析法快速檢測豬尿中克倫特羅含量[J]. 現代食品科技， 2013， 29（5）： 1154-1156.

[21] 方琦， 黃錫榮， 李凱， 等. 降鈣素原熒光免疫層析定量檢測方法的建立及性能評估[J]. 中華檢驗醫學雜志， 2012， 35（12）： 1102-1107. DOI：10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2012.12.011.

[22] 李軍， 劉蓮娜， 孟曉璐， 等. 硝基呋喃類藥物膠體金免疫層析試紙條的研制[J]. 畜牧與獸醫， 2014， 4（1）： 74-77.

[23] 李春生， 劉靜靜， 杜順豐， 等. 呋喃唑酮代謝物單克隆抗體和膠體金免疫層析試紙條的研制[J]. 現代食品科技， 2017， 43（3）： 326-331. DOI：10.13982/j.mfst.1673-9078.2017.6.048.

[24] 葛懷禮， 王蓮， 李金卿， 等. 鹽酸克倫特羅熒光定量檢測試劑盒質量評價[J]. 中國畜牧獸醫， 2014， 41（10）： 285-289.

[25] 郭艷宏， 李飛， 鄒明強， 等. 用于檢測氯霉素類殘留物的熒光免疫檢測試紙條的研制[J]. 化學試劑， 2010， 32（6）： 496-498. DOI：10.3969/j.issn.0258-3283.2010.06.005.

[26] 范放， 朱海， 洪小柳， 等. 氯霉素熒光納米顆粒免疫層析法的建立[J]. 現代農業科學， 2009， 16（9）： 13-14.

[27] 段宏， 陳雪嵐， 江湖， 等. 量子點熒光微球免疫層析試紙條定量檢測惡性惡性瘧原蟲[J]. 分析化學， 2015， 43（3）： 338-343. DOI：10.11895issn.0253-3820.140848.

[28] ZHANG Mingxia， LI Cun， WU Yinliang. Determination of phenylethanolamine A in animal hair， tissues and feeds by reversed phase liquid chromatography tandem mass spectrometry with QuEChERS[J]. Journal of Chromatogrephy B， 2012， 900： 94-99. DOI：10.1016/j.jchromb.2012.05.030.

[29] 胡佳麗， 于東升， 劉小雷， 等. 熒光免疫層析法快速測定牛奶中頭孢氨芐殘留量[J]. 中國食品衛生雜志， 2014， 26（4）： 362-366. DOI：10.13590/j.cjfh.2014.04.015.

[30] 胡華軍， 付濤， 張明洲， 等. CdTe/ZnSe殼核量子點免疫層析試紙條檢測科倫特倫的研究[J]. 分析化學， 2010， 38（12）： 1727-1731. DOI：10.3724/SP.J.1096.2010.01727.

[31] 何方洋， 馮才偉， 孫震， 等. 飼料中硝基呋喃類藥物免疫膠體金檢測試紙條的研制[J]. 飼料工業， 2012， 33（23）： 35-38.

[32] 趙正苗， 羅曉琴， 汪善良， 等. 應用膠體金免疫層析法檢測動物組織中呋喃西林代謝物的殘留[J]. 上海畜牧獸醫通訊， 2012， 5： 4-5.

[33] XIANG Y， ZHANG H X， JIANG B Y， et al.Quantum dot layer-by-layer assemblies as signal amplification labels for ultrasensitive electronic detection of uropathogens[J]. Analytical chemistry， 2011， 83（11）： 4302-4306.

[34] SONG Suquan， LIU Na， ZHAO Zhiyong， et al. Multiplex lateral flow immunoassay for mycotoxin determination[J]. Analytical Chemistry， 2014， 86（10）： 4995-5001.

[35] 李丹妮， 黃華， 張倩， 等. 3 種β-受體激動劑熒光免疫層析試紙條的制備及特性研究[J]. 中國畜牧獸醫， 2017， 44（8）： 2437-2442. DOI：10.16431/j.cnki.1671-7236.2017.08.031.