伊維菌素吡喹酮咀嚼片含量測定方法的建立

韓寧寧，趙富華，戴青，趙暉，楊秀玉，于曉輝

(中國獸醫藥品監察所，北京 100081)

伊維菌素吡喹酮咀嚼片是“十二五”國家科技支撐計劃項目研制的新制劑，由伊維菌素、吡喹酮和賦形劑制成的咀嚼片，用于寵物犬體內外寄生蟲的治療。伊維菌素是大環內酯類體內外驅蟲藥[1]，對絲蟲、鉤蟲、圓蟲、鞭蟲、蛔蟲等均有效果；吡喹酮[2]對動物體內線蟲、吸蟲、絳蟲有效。通過兩種藥物組合，擴大驅蟲譜，可提高一次性驅蟲效果。為保證該制劑的質量可控，安全有效，需建立相應含量測定方法。本文創建了同時測定伊維菌素與吡喹酮的高效液相含量測定方法，并根據《獸藥質量標準分析方法驗證指導原則》[3]的要求，對上述方法進行了驗證。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與設備 高效液相色譜儀(HPLC)(Waters e2695色譜系統，Empower 3色譜工作站)；二極管陣列檢測器(PDA)(Waters 2998)；XS205分析天平(Mettler Toledo)。

1.2 藥品與試劑 對照品名稱/來源/批號/含量：伊維菌素/中國獸醫藥品監察所/K0191406/91.0%；吡喹酮/中國食品藥品檢定研究院/100046-201205/99.7%。3批伊維菌素吡喹酮咀嚼片規格/生產企業/批號：伊維菌素2 mg與吡喹酮50 mg/東方澳龍制藥有限公司/20170501、20170502、20170503。乙腈(MERCK公司色譜純試劑)。其余試劑均為分析純。

2 方 法

2.1 方法的建立過程

2.1.1 液相色譜條件的建立 采用《中國獸藥典》吡喹酮含量測定液相色譜條件(乙腈∶水60∶40)，采集吡喹酮與伊維菌素混合對照品色譜圖，發現該條件下吡喹酮出峰時間為6 min，伊維菌素出峰時間為120 min。如采用該色譜條件僅進行吡喹酮含量測定，伊維菌素會對多批次測定的后續樣品的吡喹酮含量測定產生干擾。

為排除伊維菌素對吡喹酮測定的干擾，保證測定結果的準確性，需將伊維菌素與吡喹酮的液相色譜條件合并。合并后的色譜條件需使伊維菌素與吡喹酮在20 min內均出峰，溶劑及輔料對主成分測定需均無干擾，且相應分離度及塔板數均應符合藥典要求。

2.1.2 提取溶劑的選擇 分別用甲醇及60%乙腈溶液配制0.2 mg/mL的伊維菌素對照品溶液和5.0 mg/mL的吡喹酮對照品溶液(上述濃度與供試品擬采用的配制濃度一致)。考察對照品是否能完全溶解，根據測定結果選擇合適的溶劑。

2.1.3 提取時間的選擇 取片劑適量，研磨后精密稱定，置錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，平行制備4份。各自分別超聲0、2、5、10 min，配制相當于伊維菌素0.2 mg/mL的供試品溶液，測定含量，考察提取時間。根據測定結果選擇合適的提取時間。

2.1.4 溶液濃度的選擇 《中國獸藥典》中伊維菌素進樣濃度為0.2 mg/mL，吡喹酮為0.05 mg/mL。照上述方法配制相當于伊維菌素0.2 mg/mL的溶液及相當于吡喹酮0.05 mg/mL的溶液，考察測定含量與標示含量的差異。通過測定回收率，進一步確定配制方法準確度是否符合要求。

2.1.5 檢測波長的選擇 《中國獸藥典》中伊維菌素檢測波長為254 nm，USP中伊維菌素檢測波長為245 nm。《中國獸藥典》及USP中吡喹酮檢測波長均為210 nm。通過PDA檢測器采集伊維菌素及吡喹酮光譜圖，考察伊維菌素與吡喹酮最大吸收波長，并結合各藥典方法，確定合適的檢測波長。

2.2 最終建立的含量測定方法 色譜條件與系統適用性試驗。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以水為流動相A，以乙腈為流動相B，照表1進行梯度洗脫，伊維菌素檢測波長為245 nm，吡喹酮檢測波長為210 nm。理論塔板數按吡喹酮峰和伊維菌素H2B1a峰計算，均應不低于3000，伊維菌素H2B1a與H2B1b峰的分離度應不小于3.0，吡喹酮峰與相鄰峰的分離度應不小于1.5。

測定法。取本品20片，精密稱定，計算平均片重。研細，取約0.8 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲5 min，靜置至室溫，取上清液過濾，作為伊維菌素供試品溶液；精密量取上述溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為吡喹酮供試品溶液。取伊維菌素和吡喹酮對照品適量，用甲醇分別配制為每1 mL中約含0.2 mg和0.05 mg的溶液，作為對照品溶液，同法測定。精密量取上述對照品溶液和供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算，即得。

表1 含量測定梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution condition for content determination

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性 采集提取溶劑、輔料、對照品及供試品溶液色譜圖，考察提取溶劑及輔料在伊維菌素及吡喹酮出峰時間有無干擾。

2.3.2 檢測限與定量限 配制不同濃度伊維菌素及吡喹酮對照品溶液測定相應信噪比，以信噪比約為3∶1時的濃度為檢測限，信噪比約為10∶1時的濃度為定量限。

2.3.3 線性和范圍 分別配制濃度為2、4、10、20、40、80、200、400 μg/mL的伊維菌素對照品溶液，及濃度為1、2、5、10、20、50、100 μg/mL的吡喹酮對照品溶液，采集色譜圖，以峰面積與對照品濃度作圖，用最小二乘法進行線性回歸。考察在上述兩個濃度范圍內，伊維菌素及吡喹酮峰面積與濃度是否線性關系良好。

2.3.4 準確度 取空白輔料0.75 g，精密加入伊維菌素對照品2 mg及吡喹酮對照品50 mg，置錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲5 min，靜置至室溫，取上清液濾過，精密量取濾液20 μL注入液相色譜儀，采集245 nm色譜圖。精密量取續濾液1 mL，置100 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液20 μL注入液相色譜儀，采集210 nm色譜圖。平行配制6份上述100%濃度水平的供試品溶液，分別測定伊維菌素及吡喹酮回收率。

2.3.5 精密度(中間精密度) 兩位檢驗員各測定該批片劑的3份平行樣品，伊維菌素相對平均偏差應小于6%，吡喹酮相對平均偏差應小于4%。

2.3.6 溶液穩定性 考察伊維菌素及吡喹酮對照品溶液室溫放置24 h內不同時間點伊維菌素及吡喹酮主峰面積的變化以評價溶液穩定性。

2.3.7 耐用性 考察不同柱溫(25、30、35 ℃)、流速(0.8、1.0、1.2 mL/min)、不同品牌色譜柱對耐用性的影響。

3 結果與分析

3.1 方法的建立過程

3.1.1 液相色譜條件的建立 采用整合后的色譜系統(表1)，使吡喹酮在乙腈∶水(60∶40)的梯度范圍(0～6 min)內出峰，伊維菌素在乙腈∶水(100∶0)的梯度范圍(6.01～17 min)內出峰，溶劑及輔料對主成分測定均無干擾，且相應分離度及塔板數均符合藥典要求(圖3～圖10)。

3.1.2 提取溶劑的選擇 甲醇或60%乙腈兩種溶劑均可使兩種對照品完全溶解。考慮到甲醇作為溶劑無需配制，更為簡單方便，選取甲醇作為提取溶劑。

3.1.3 提取時間的選擇 根據表2結果，超聲5 min后，測定結果不再升高，提示主成分已全部溶解。因此，確定提取方式為：以甲醇作為溶劑，超聲5 min。

表2 提取時間的選擇Tab 2 Selection of extraction time

3.1.4 溶液濃度的選擇 照2.1.4所示濃度配制供試品溶液，三批供試品測定含量均在標示含量的100%左右，結果見表3。回收率結果見3.2.4項，伊維菌素與吡喹酮回收率均符合要求。提示伊維菌素進樣濃度為0.2 mg/mL，吡喹酮進樣濃度為0.05 mg/mL為合理的溶液濃度。

3.1.5 檢測波長的選擇 通過PDA檢測器采集伊維菌素及吡喹酮光譜圖，發現伊維菌素最大吸收波長為244.2 nm，吡喹酮在200～230 nm之間無明顯波峰，但吸收由高至低下降(圖1～圖2)。故采用245 nm作為伊維菌素的檢測波長，210 nm作為吡喹酮的檢測波長。

表3 三批供試品含量測定結果Tab 3 Determination results of three batches of samples

圖1 伊維菌素H2B1a PDA光譜圖Fig 1 PDA spectrum of Ivermectin H2B1a

圖2 吡喹酮PDA光譜圖Fig 2 PDA spectrum of praziquantel

3.2 方法學驗證

3.2.1 專屬性 提取溶劑及輔料在伊維菌素及吡喹酮出峰時間均無干擾(圖3～圖10)。

3.2.2 檢測限與定量限 該方法伊維菌素H2B1a檢測限為0.4 μg/mL，定量限為1.2 μg/mL。吡喹酮檢測限為0.5 μg/mL，定量限為1.0 μg/mL。

圖3 甲醇在210nm下色譜圖Fig 3 Chromatogram of methanol at 210 nm

圖4 輔料在210nm下色譜圖Fig 4 Chromatogram of excipients at 210 nm

圖5 吡喹酮對照品在210nm下色譜圖Fig 5 Chromatogram of praziquantel reference at 210 nm

圖6 供試品在210nm下色譜圖Fig 6 Chromatogram of the sample at 210 nm

圖7 甲醇在245nm下色譜圖Fig 7 Chromatogram of methanol at 245 nm

圖8 輔料在245nm 下色譜圖Fig 8 Chromatogram of excipients at 245 nm

圖9 伊維菌素對照品在245nm下色譜圖Fig 9 Chromatographic Chart of Ivermectin Reference at 245 nm

圖10 供試品在245nm下色譜圖Fig 10 Chromatogram of the sample at 245 nm

3.2.3 線性和范圍 伊維菌素峰面積與濃度線性方程為：y=41323x-95474，r=0.9999；吡喹酮峰面積與濃度線性方程為：y=95361x-27338，r=0.9999。表明伊維菌在2～400 μg/mL的濃度范圍內，吡喹酮在1～100 μg/mL的濃度范圍內，峰面積與濃度線性關系良好。

3.2.4 準確度 處方回收率結果如表4所示。結果符合要求。

3.2.5 中間精密度 結果如表5～表6所示。結果符合要求。

表4 伊維菌素及吡喹酮回收率結果Tab 4 Result of recovery of ivermectin and praziquantel

表5 伊維菌素精密度測定結果Tab 5 Precision determination results of ivermectin

表6 吡喹酮精密度測定結果Tab 6 Precision determination results of praziquantel

3.2.6 溶液穩定性 結果如表7所示。伊維菌素對照品溶液在室溫放置2 h內穩定，之后峰面積逐漸降低，但24 h內RSD仍僅為0.9%，基本穩定；吡喹酮對照品溶液在室溫放置24 h穩定。

3.2.7 耐用性 結果如表8所示。在該表所述各個條件下，理論塔板數按H2B1a峰計算均不低于3000，伊維菌素H2B1a與H2B1b峰的分離度均不小于3.0，理論板數按吡喹酮峰計算均不低于3000。

4 討論與結論

由于處方中伊維菌素與吡喹酮兩種主藥規格差異較大(2 mg與50 mg)，如果為簡化試驗操作，采用相同的進樣濃度，在伊維菌素與吡喹酮各自的最大吸收波長(245 nm與210 nm)附近提取色譜圖，會導致伊維菌素峰面積過小，或者吡喹酮峰面積過載，二者均影響測定的準確性，因而本方法伊維菌素和吡喹酮采用了兩種不同的供試品濃度進樣。

但如果伊維菌素和吡喹酮均采用245 nm作為提取波長，采用未經第二步稀釋的伊維菌素供試品溶液進樣，同時測定伊維菌素和吡喹酮，二者峰面積均處于合適的范圍(圖11)，且無需進一步稀釋配制吡喹酮供試品溶液，簡化了試驗操作。采用該簡化方法測定批號為20170502的供試品，結果與最終采用的方法相比，無顯著差異(表9)。但考慮到245 nm恰好處于吡喹酮紫外光譜圖的波谷位置，儀器對于濃度變化的靈敏度較低，易產生試驗誤差，因此，最終未采用該簡化方法。

表7 伊維菌素及吡喹酮穩定性結果Tab 7 Stability results of ivermectin and praziquantel

表8 耐用性結果Tab 8 Durability results

圖11 245 nm下伊維菌素與吡喹酮色譜圖Fig 11 Chromatogram of ivermectin and praziquantel at 245 nm

供試品含量1/%供試品含量2/%平均值/%簡化方法98.7799.0298.9最終采用的方法98.2199.5698.9