增精寶對環磷酰胺致小鼠生精障礙保護作用的研究

蘭新財，葉志惠，歐 彬，趙麗麗，麻軍法，盧 駿

(浙江金大康動物保健品有限公司，浙江金華321016)

中醫認為，雄性動物性欲下降、精液質量差是因為肝腎不足，氣血虧損所致。許多補益肝腎的中藥如金匱腎氣丸、右歸丸等均有提高性欲、改善精液質量的作用。增精寶由黃芪、山藥、茯苓、車前子等組成，具有補腎填精、壯陽催情、補益氣血的作用。本試驗旨在利用環磷酰胺腹腔注射致炎癥動物模型，進而采用增精寶灌胃給藥，觀察小鼠的臨床表現、生長的影響，并通過精子密度和活率、精子凋亡狀態、組織形態學等方法檢測，探討兩種劑量濃度的增精寶對環磷酰胺導致小鼠生精障礙的保護作用。

1 材 料

1.1 試驗藥物 注射用環磷酰胺(由江蘇恒瑞醫藥股份有限公司提供，規格：0.2 g，批號：HA-30-01-728)。增精寶(由浙江金大康動物保健品有限公司提供，批號：20180508，試驗給藥劑量定為低劑量組0.6 g/kg·b.w.，高劑量組1.8 g/kg·b.w.)；本品由黃芪、山藥、茯苓、車前子等8味藥材，經兩次水提，濾過，減壓濃縮至1 mL相當于1 g原生藥。

1.2 試驗動物 試驗動物：ICR小鼠，SPF級，雄性，8～9 周齡，動物來源：南京市江寧區青龍山動物繁殖場提供，合格證SCXK(蘇)2017-0001。

1.3 試驗材料 異氟醚、生理鹽水、FITC Annexin V Apoptosis Detection KitⅠ(BD)、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(南京建成生物工程有限公司)、1%乳酸鈉水溶液、丙酮酸鈉、硫酸慶大霉素、酚紅、人血清白蛋白、HEPES、鼠糧、墊料、小鼠籠8個、水瓶、電子稱、灌胃針8號(直頭、彎頭)、注射器2 mL、200目尼龍網、打耳鉗、手術器械、量筒、乳膠手套、燒杯、解剖器械。

2 試驗方法

2.1 飼養管理 試驗動物飼養于清潔、安靜的環境中，環境溫度控制在20 ℃左右，自然光照，飼喂鼠全價顆粒料，自由采食和飲水。試驗前適應性飼養3 d，觀察其健康狀況，選擇健康、營養狀況良好的進行試驗。

2.2 試驗分組 40只雄性小鼠，隨機分為4組，依次為空白對照組(CG)、模型組(MG)、增精寶低劑量組(SG)、增精寶高劑量組(LG)。除空白對照組外，其余小鼠腹腔注射環磷酰胺50 mg/kg，連續注射7 d，空白對照組腹腔注射等量生理鹽水。空白對照組和模型組每天灌服1% 羧甲基纖維素鈉0.2 mL；增精寶分別設低劑量組給予量和高劑量組給予量，各組小鼠連續給藥35 d。

2.3 常規觀察 分別于0(試驗開始)、7、14、21、28、35、42 d每天早上于固定時間點測定各組小鼠的飲食量、飲水量、體重，觀察小鼠外觀、精神狀態等變化情況。

2.4 睪丸指數、附睪指數、儲精囊指數和前列腺指數測定 小鼠末次給藥后12 h，禁食不禁水，稱量體重、眼球采血后，脫頸處死，剖取睪丸、附睪、儲精囊、前列腺，濾紙吸取表面殘血及多余水分，稱取濕重，計算睪丸指數、附睪指數、儲精囊指數和前列腺指數。

2.5 小鼠精子密度及精子活率的測定 雙側附睪置于潔凈培養皿中，用眼科剪沿附睪縱軸剪一刀使其分為大致均勻的2半，然后沿橫軸剪2刀使附睪分為大致均勻的6段，將剪碎的附睪組織移入預置常溫孵育緩沖液1 mL的試管中，然后用1 mL孵育緩沖液沖洗培養皿，沖洗液移入裝附睪的試管中。

摘取睪丸和附睪后，分離輸精管，于輸精管與附睪尾結合部、輸精管與前列腺結合部剪切離斷輸精管。用胰島素注射針抽取孵育緩沖液1 mL，沿輸精管一側斷端將針頭插入輸精管管腔內，輕推注射器，可見另一側斷端流出1～2滴乳白或灰白色液體，內含大量精子，將所得液體滴入裝附睪的試管中，并用注射器中剩余孵育緩沖液沖洗輸精管管腔，并將液體全部滴入裝附睪的試管中。將所得精子置于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min備用。

精子于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min后，小心吸取上層液體，1500 r/min離心5 min，沉淀物加入1 mL Bww高蛋白獲能液，置于37 ℃恒溫孵育箱中獲能2 h，取1滴滴入牛鮑氏血細胞計數板上，計算每毫升精子數，精液涂片，伊紅染色，進行精子活率測定(10 μL伊紅∶10 μL精子懸液，死精子頭部被染成紅色，活精子不著色，隨機觀察200個精子，計算存活率)。

2.6 小鼠睪丸各倍體生精細胞比例的影響 精子于37 ℃恒溫孵育箱中孵育30 min后，小心吸取上層液體，1500 r/min離心5 min，沉淀物加入PBS液洗滌、離心、去上清液，重復洗滌2次，用冷PBS液稀釋精子懸液，取1×106個精子于試管中，加PBS液洗滌、離心，管中，加入FITC-AnnexinV 10 μL和PI 0.3 μg染色，室溫下避光靜置15 min后加400 μL孵育緩沖液，用流式細胞儀檢測精子凋亡率，結果以AV/PI表示。

2.7 小鼠睪丸組織形態學觀察 取單側睪丸石臘切片，HE染色，光鏡觀察睪丸組織內精原細胞與各級生精細胞的分布。

3 結果與分析

3.1 臨床表現 試驗過程中，各組小鼠精神狀態良好，毛發順暢，采食飲水正常，糞便干燥無異常，未觀察到臨床可見的異常情況。小鼠體重量逐漸增加，體毛有光澤，活動敏捷，造模中后期相互打斗明顯，多數小鼠在尾部、背部可見明顯傷痕。試驗結束后，剖檢大體檢查，內臟器官均正常，未見到器官實質病變(圖1～圖4)。

3.2 體重的影響 試驗時隨機分成四組飼養并分別進行相關參數的統計。從表1可以看出，整個試驗過程中兩種劑量濃度的增精寶對環磷酸酰導致小鼠的增重有影響，從統計學角度來看，14、21 d期間體重差異顯著(P<0.05)，28 d后體重差異不顯著。表明與對照組相比腹腔注射環磷酰胺導致其余三組小鼠體重增長幅度明顯下降(圖5)。

表1 對小鼠體重的影響Tab 1 Effects on body weight of mice

*與空白組差異顯著(P<0.05)；**與空白組差異極顯著(P<0.01)

*There was a significant difference between control group*(P<0.05),**control group (P<0.01)

圖1 局部解剖(從左到右：空白組、模型組、低劑量組、高劑量組)Fig 1 Local anatomy (from left to right: control group, model group, low dose group, high dose group)

圖2 生殖系統大體解剖Fig 2 General anatomy of the reproductive system

圖3 四組睪丸形態大小變化Fig 3 Changes of testicular morphology and size in four groups

圖4 四組儲精囊、前列腺、膀胱形態大小變化Fig 4 Morphological and size changes of seminal vesicle, prostate and bladder in four groups

圖5 小鼠體重變化趨勢圖Fig 5 Trend Chart of Weight Change in Mice

3.3 對器官指數的影響 將兩種劑量的增精寶連續給小鼠灌胃5周后，進行剖檢測定生殖器官(附睪、睪丸、儲精囊和前列腺)指數，結果見表2～表3。由表可見，低劑量組與模型組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺的器官指數均低于空白組，但高劑量組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺均有較顯著的促進作用，但對前列腺的影響較小。

3.4 小鼠精子密度及精子活率的測定 結果見表4。

3.5 小鼠睪丸各倍體生精細胞比例的影響(對精子行FITC-AV/ PI 染色后用流式細胞儀檢測精子凋亡率) 從表5中可以看出，模型組和低劑量組小鼠精子凋亡率顯著高于對照組小鼠，而高劑量組小鼠精子凋亡率與對照組小鼠無顯著差異(圖6)。

3.6 對小鼠睪丸組織形態學的影響 HE結果表明空白組小鼠生精小管管腔飽滿，生精上皮外的界膜均勻、完整；生精上皮厚度適中，可見不同發育階段的生精細胞及成熟的精子；管腔內可見密度適當的精子；睪丸間質細胞排列均勻，疏松結締組織中微血管豐富；TUNEL結果表明空白組睪丸生精小管中凋亡精子數目很少，且結構特征與HE一致(圖7)。

表2 對小鼠生殖器官指數的影響Tab 2 Effect on Reproductive Organ Index in Mice

表3 對小鼠生殖器官尺寸大小的影響Tab 3 Effect on the Size and Size of Reproductive Organs in Mice

*與空白組差異顯著(P<0.05)

*Significant difference was found compared with control group (P<0.05)

表4 小鼠精子密度及活動能力比較Tab 4 Comparison of sperm density and motility in mice

*與空白組差異顯著(P<0.05)；**與空白組差異極顯著(P<0.01)

*There was a significant difference compared with control group (P<0.05),**There was a significant difference compared with control group (P<0.01)

表5 精子凋亡率( ± SD)Tab 5 Sperm Apoptosis Rate

*與空白組差異顯著(P<0.05)；**與空白組差異極顯著(P<0.01)

*There was a significant difference compared with control group (P<0.05),**There was a significant difference compared with control group (P<0.01)

圖6 四組小鼠附睪精子細胞凋亡情況Fig 6 Apoptosis of Sperm Cells in Epididymis of Mice in 4 groups

圖7 空白組睪丸組織(HE；TUNEL)Fig 7 Testicular tissue of blank group (HE; TUNEL)

模型組小鼠睪丸變形、塌陷的生精小管數量增多；界膜變薄，部分脫落；生精小管上皮變薄，各級生精細胞數量顯著減少；管腔面精子數量顯著減少甚至沒有；多數生精小管可見生精細胞脫落及排列紊亂；睪丸間質細胞排列稀疏；該組睪丸生精小管稀疏，且管腔內有強陽性反應，但生精小管中精子數量極少(圖8)。

圖8 模型組睪丸組織(HE；TUNEL)Fig 8 Testicular tissue of model group (HE; TUNEL)

低劑量組小鼠睪丸生精小管管腔較大，管腔內存在少量的精子，各級生精細胞數目顯著減少，睪丸間質細胞排列適中；該組生精上皮呈弱陽性，管腔有部分弱陽性凋亡精子(圖9)。

圖9 低劑量組睪丸組織(HE；TUNEL)Fig 9 Testicular tissue in low dose group (HE; TUNEL)

高劑量組小鼠睪丸生精小管較為飽滿，管腔內存在大量精子，生精上皮較厚，可見各級生精細胞排列整齊，界膜明顯，睪丸間質細胞排列整齊；生精上皮含有部分凋亡細胞，而管腔呈陰性(圖10)。

圖10 高劑量組睪丸組織(HE；TUNEL)Fig 10 Testicular tissue of high dose group (HE; TUNEL)

4 討論與結論

機體生殖系統擔負著調節生命體多種生理功能的任務，對保證其正常的生理活動至關重要。雄性的生殖系統包括成對的睪丸、附睪、輸精管、副性腺及單一的尿生殖道、陰莖等器官。其主要功能是產生、儲存、運送精子。精子以及精液的生物學功能的破壞直接導致雄性不育的危害疾病。本研究通過腹腔注射環磷酰胺制造小鼠生精障礙動物模型，其后經灌胃增精寶研究該藥物對環磷酰胺致小鼠生精障礙的治療及保護作用。

環磷酰胺(cyclophosphamide，CP)是一種細胞毒性化療藥物，可破壞DNA結構，阻斷復制，從而導致細胞死亡。因環磷酰胺具有較強的免疫抑制作用，故在免疫毒理學中是制備免疫抑制模型的常用陽性物[1-2]。

賈慶軍[3]等對雄性小鼠進行腹腔注射環磷酰胺30 mg/kg藥物，持續注射5 d，到第28天收集成對的附睪和睪丸，發現小鼠精子的畸形率明顯升高，表明腹腔注射環磷酰胺對小鼠生精細胞具有損傷的功能。本研究結果表明，以50 mg/kg腹腔注射環磷酰胺，連續注射7 d，收集附睪液制成精子涂片發現模型組小鼠精子畸形率較高，表明造模成功，然后再以低劑量和高劑量增精寶灌胃治療小鼠，與空白組相比，低劑量與高劑量增精寶組精子畸形率較低。

Kim等[4]每天給大鼠注射100 mg/kg環磷酰胺，連續給藥56 d后檢測大鼠睪丸毒性參數，發現大鼠的睪丸和附睪精子數均減少，附睪精子活力明顯下降，精母細胞液泡化。這些動物實驗證明環磷酰胺能夠對小鼠睪丸和附睪造成一定的生殖障礙。Li等[5]和Aghaie等[6]均采用腹腔注射的給藥方式給大鼠注射環磷酰胺，用兩種措施即每日20 mg/kg和一次性注射100 mg/kg，均發現大鼠的睪丸相對重量、睪酮水平和附睪精子數均明顯下降，因此環磷酰胺對大鼠睪丸具有較強的毒性作用。本試驗中，腹腔注射環磷酰胺，連續7 d，導致小鼠體重明顯低于空白組小鼠體重，隨后經增精寶藥物的不同劑量灌胃后模型組、低劑量組、高劑量組與空白組小鼠體重有明顯差異。高劑量組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺的器官指數均有較顯著的促進作用。

羅少波等[7]給昆明雄性小鼠腹腔注射環磷酰胺60 mg/kg，每天1次，連續5 d，在34 d對睪丸做組織病理切片進行形態學觀察，發現塌陷的生精小管數量增多，上皮變薄，各級生精小管數量顯著減少，管腔精子數量顯著減少。并對小鼠精子進行精液常規分析，發現精子密度、活力、成活率均下降，由此可知腹腔注射環磷酰胺可增加小鼠的精子凋亡率，生精功能降低。高學勇[8]等給SD大鼠腹腔注射環磷酰胺20 mg/kg，每天1次，連續5 d，用藥兩個月后，用HE染色法制片觀察形態，并用原位缺口末端標記法(TUNEL法)檢測細胞凋亡。研究發現大鼠的生精小管直徑縮小，間距增寬，生精細胞的數目減少，生精小腔內大多未見精子形成，腔內精子稀少，含有大量脫落細胞，生精細胞凋亡增多，通過TUNEL法檢測發現，環磷酰胺可引起各階段生殖細胞凋亡，但以Ⅰ-Ⅳ和Ⅺ-Ⅱ階段的精原細胞和精母細胞最為顯著。張長城等[9]腹腔注射環磷酰胺50 mg/kg于小鼠體內，每日1次，連續7 d，測定小鼠生殖器官重量、精子密度與存活率、生精細胞各倍體比例。研究表明小鼠睪丸和附睪重量明顯低于正常小鼠，精子密度和存活率顯著降低，精原細胞和精子細胞百分比下降，初級精母細胞顯著升高，注射環磷酰胺后小鼠生殖器官重量下降，初級精母細胞和精子顯著降低，影響小鼠生精能力。本實驗中，對各組小鼠睪丸組織病理切片進行觀察發現，空白組小鼠睪丸生精小管管腔飽滿，生精上皮外的界膜均勻、完整；生精上皮厚度適中，可見不同發育階段的生精細胞及成熟的精子；管腔內可見密度適當的精子；睪丸間質細胞排列均勻，疏松結締組織中微血管豐富。模型組小鼠睪丸組織塌陷的生精小管數量增多，上皮變薄，各級生精小管數量顯著減少，管腔精子數量顯著減少；低劑量組小鼠睪丸組織排列適中，各生精小管管腔較大，內含少量精子，生精上皮較薄；高劑量組小鼠睪丸生精小管較為飽滿，管腔內存在大量精子，生精上皮較厚，可見各級生精細胞排列整齊，界膜明顯，睪丸間質細胞排列整齊。

環磷酰胺腹腔注射后，模型組小鼠出現精子密度、活力和活率明顯下降，而精子凋亡率顯著增加，與空白組小鼠相比有顯著差別，與病理檢查結果相符合，出現明顯的少弱精癥表現。另模型組小鼠在實驗中還出現精神萎靡、活動減少、惡寒、體毛稀疏、無光澤等類似于中醫“腎虛”的癥狀和體征。

環磷酰胺的生殖毒性很強，如何降低其毒性是當今熱議的話題。黃威峰等[10]通過實驗發現五子衍宗方可通過減少環磷酰胺造成的睪丸生殖細胞凋亡使其藥物毒性降低。郭錫春等[11]發現海參精囊提取物可提高環磷酰胺所致的睪酮分泌降低，保護受損的生殖功能。楊金鳳[12]發現姜黃素可通過抑制睪丸氧化損傷，提高抗氧化能力來降低環磷酰胺毒性。同時菟絲子水提取液、CMTM2、淫羊藿總黃酮等都對環磷酰胺的毒性具有拮抗作用，使其損傷減弱。

增精寶由黃芪、山藥、茯苓、車前子等組成，具有補腎填精、壯陽催情、補益氣血的作用，具有提高性欲、改善精液質量的作用。增精寶兩種劑量均能夠顯著的促進環磷酰胺導致小鼠生精障礙的保護作用，高劑量組對雄性小鼠的作用尤為顯著，可能與增精寶補腎填精、壯陽催情、補益氣血的功效相關。

通過試驗表明：對于小鼠體重的影響，14、21 d期間體重差異顯著(P<0.05)，28 d后體重差異不顯著。表明與空白組相比腹腔注射環磷酰胺導致其余三組小鼠體重增長幅度明顯下降；對于小鼠器官指數的影響，低劑量組與模型組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺的器官指數均低于空白組，但高劑量組對小鼠的附睪、睪丸、儲精囊和前列腺均有較顯著的促進作用；對于小鼠精子密度及精子活率的影響，與空白組比較，低劑量組精子總密度和精子活率均差異顯著(P<0.05)；高劑量組精子總密度差異不顯著(P>0.05)，精子活率差異顯著(P<0.05)；對小鼠睪丸各倍體生精細胞比例的影響，模型組和低劑量組小鼠精子凋亡率顯著高于空白組小鼠，而高劑量組小鼠精子凋亡率與空白組小鼠無顯著差異；對小鼠睪丸組織形態學的影響，低劑量組小鼠睪丸組織排列適中，各生精小管管腔較大，內含少量精子，生精上皮較薄；高劑量組小鼠睪丸生精小管較為飽滿，管腔內存在大量精子，生精上皮較厚，可見各級生精細胞排列整齊，界膜明顯，睪丸間質細胞排列整齊。

增精寶兩種劑量均能夠顯著的促進環磷酰胺導致小鼠生精障礙的保護作用，高劑量組對雄性小鼠的作用尤為顯著。這說明兩種劑量的增精寶對小鼠生殖系統的調節作用受劑量的影響較大，在一個合理的劑量范圍內能表現出強大的生精刺激作用。