雙指標評價核桃蛋白酶法增溶改性

張 汆 劉 洋 陳志宏 儲晶晶 何曉偉

(滁州學院生物與食品工程學院，滁州 239000)

核桃(JuglansRegiaL.)屬胡桃科植物，其種子與扁桃、腰果、榛子并稱為世界著名的“四大干果”。核桃自漢代傳入中國，2010年中國核桃種植面積及總產量超越美國， 2017年，中國核桃產量為189萬t，占世界總產47%，居世界第一[1]。核桃仁中含有豐富的油脂(65%～70%)、蛋白質(14.6%～19.0%)、碳水化合物(5.4%～10.0%)、磷脂、維生素和礦物質等營養組分[2-3]。核桃油中不飽和脂肪酸含量豐富，如，油酸11.5%～25%、亞油酸50%～69%、亞麻酸6.5%～18%等總量90%以上，是一種高檔、保健型的膳食油脂[4-6]。

脫脂后的核桃餅粕是優質的膳食蛋白資源，其中蛋白質以水不溶性的谷蛋白(70.11%)和醇溶蛋白(5.33%)為主[3,7]。由于核桃蛋白中75%以上的都是水不溶性蛋白質，使其分離提取和在食品中的應用受到限制，因此，如何有效提取核桃餅粕中的蛋白質、提高其溶解性是核桃蛋白研究的主要內容。

目前，脫脂核桃餅粕中蛋白質的分離提取方法多為酶法，這方面的研究報道很多，所用的酶主要有：胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、風味蛋白酶等[8-12]。利用酶法水解脫脂核桃餅粕制備各種核桃肽是目前的研究熱點[10]。肽類易吸收、有一定保健功效，但是分子量較小的肽類不僅不易保存，易被氧化、易吸濕、潮解，而且喪失了蛋白質的一些功能性質，如黏度、起泡性、乳化性等[13，14]。因此，為了獲得一種既能提高核桃蛋白溶解度，又能保持其作為大分子功能特性的方法，本研究在分析木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶對脫脂核桃粉中蛋白質水解的基礎上，選擇一種復合酶解方法，可明顯提高核桃蛋白的溶解性，為核桃蛋白在食品中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

部分脫脂核桃粉，食品級。

磷酸鹽、水合茚三酮、氯化亞錫等，均為分析純試劑。

耐高溫α-淀粉酶(4萬U/g，食品級)，木瓜蛋白酶(200萬U/g)、菠蘿蛋白酶(120萬U/g)、風味蛋白酶(80萬U/g)。

1.2 主要儀器設備

DHS16-A型水分測定儀，1601160S型杜馬斯燃燒儀，T6型可見分光光度計，LG-10B型真空冷凍干燥機，A300型全自動氨基酸分析儀，YRE-301型減壓旋轉蒸發儀等。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預處理

脫脂：將部分脫脂的核桃粉粉碎(過60目篩)，以石油醚(30～60 ℃)為脫脂溶劑，采用索氏脂肪提取儀連續脫脂處理6～8 h后，揮發有機溶劑后，即可得到脫脂核桃粉(Defatted walnut flour，DWF)。

去淀粉：將DWF與水按1 ∶10比例混合攪拌，經過95 ℃水浴加熱糊化15 min，取出、降溫至50～60 ℃時，加入1.5%耐高溫α-淀粉酶，水解2 h后，95 ℃滅酶(20 min)、離心(4 000 r/min，5 min)，沉淀水洗2～3次，最后冷凍干燥、粉碎(過60目篩)，此為脫脂脫淀粉核桃粉(Defatted and destarch walnut flour，DDWF)，備用。

1.3.2 營養組分分析

常規組分分析：水分，采用直接干燥法(GB/T-9695.15—2008)測定；脂肪，索氏提取法(GB.5009.6—2016)測定；蛋白質，杜馬斯燃燒法(GB 5009.5—2008)測定；灰分，馬弗爐直接灰化法 (GB 5009.4—2016)測定；淀粉含量：采用酸水解法(GB 5009.9—2016)。

氨基酸組分：采用全自動氨基酸分析儀測定[2]。

水解度(Degree of hydrolysis，DH，%)：采用茚三酮比色法測定[15-16]。采用茚三酮比色法測定酶解液中游離氨基酸含量，然后按照以下公式計算DH：

式中：m1為酶解液中游離氨基酸含量，g；m2為樣品質量，g；p為樣品中蛋白質含量，g/100 g。

可溶性固形物含量(Soluble solids，SS)：采用直接干燥法測定[17]。酶解結束后，滅酶，離心(4 000 r/min，5 min)，取上清液，用去離子水定容至100 mL，混勻，吸取5.0 mL，放入干凈鋁盒內，在105 ℃下干燥至恒重。取出，在干燥器內冷卻，稱量。酶解液中可溶性固形物(SS)含量按照下列公式計算：

式中：m1為5.0ml酶解液中的可溶性固形物含量，g；m2為樣品質量，g；100/5為稀釋倍數。

1.3.3 酶解方法

根據實驗設計，將一定量的DDWF放入容器，加入水，攪拌均勻，加入酶，在設定溫度下酶解一定時間。酶解結束后，在95 ℃下滅酶15 min，離心(4 000 r/min，5 min)，取上清液，定容，分析測定其水解度(DH)和可溶性固形物(SS)。

1.3.4 速溶核桃蛋白粉制備

DDWF在適宜條件下酶解，所得酶解液冷凍干燥，粉碎后，即為速溶核桃蛋白粉(Instant walnut flour，IWF)，裝袋，備用。

1.3.5 吸水性和吸油性測定

參考文獻[13]和[20]中的方法，略有改動。稱取3 g蛋白樣品，放入離心管中，然后加入10倍量去離子水(或大豆色拉油)，攪拌均勻后，25 ℃下靜置30 min，離心(4 000 r/min，5 min)，倒出上清液，倒扣離心管在吸水紙上，以去掉離心管內壁附著的水(或油)。然后，稱量，減去離心管質量，則用蛋白吸水(或吸油)后質量與蛋白樣品質量之比表示其吸水性(或吸油性)，單位為g/g。

1.4 數據處理方法

試驗數據采用Excel分析整理，繪制圖表；采用SPSS數據處理軟件對處理見差異顯著性進行分析。所有實驗數據均重復測定3次。

2 結果與分析

2.1 核桃餅粕及蛋白粉主要營養組分

DWF、DDWF及IWF中主要組分如表1所示。結果顯示，實驗所購脫脂核桃餅粕中含71.71%的蛋白質，仍殘留14.11%的油脂。經脫脂后，蛋白質質量分數提高至79.70%，殘留油脂0.95%，淀粉質量分數從9.90%提高至13.78%。采用耐高溫α-淀粉酶處理后，DDWF中的蛋白質質量分數提高至86.84%，淀粉質量分數降至2.27%。此外，脫脂、去淀粉處理，對于核桃蛋白粉的吸水性和吸油性，影響均不顯著(P≤0.05)，但是經蛋白酶增溶改性后所得IWF的吸水性和吸油性顯著高于酶解前(P≤0.05)(表1)。

目前關于核桃仁中淀粉的相關信息，文獻報道很少，具體分子結構及其功能特性還需深入研究。Savage G P 曾經測定過15種不同產地核桃仁中淀粉質量分數(1.1%～2.8%)[2]。由此推測，當脫去62.6%～70.3%的脂質后，淀粉質量分數在3%～10%范圍內。本實驗所得結果與之接近。

表1 核桃餅粕及蛋白粉主要組分含量分析

注：表中除水分含量以外，其他組分均為干基含量；表中同一行數據上角標注的相同字母表示無顯著差異，不同大寫字母表示差異極顯著(P≤0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P≤0.05)。

幾種核桃蛋白粉中氨基酸組成分析如表2所示。結果顯示，核桃蛋白粉中含量最高的氨基酸為谷氨酸和精氨酸，鮮味氨基酸(Glu、Arg)和甜味氨基酸(Gly、Ala、Ser、Lys、Met)含量總和接近50%，所以核桃蛋白粉的口感鮮甜，苦味不明顯。酶法增溶改性使核桃蛋白含量略有降低，但是其必需氨基酸含量略有增加(表2)。

表2 不同核桃蛋白粉中的氨基酸組成/%

2.2 核桃蛋白單酶水解

2.2.1 木瓜蛋白酶

圖1是底物濃度、酶濃度、酶解溫度和時間等因素對木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的影響趨勢。結果顯示，所有因素中，DH和SS都顯示出非常一致的變化趨勢。隨著底物濃度的增加，核桃蛋白DH和SS含量均呈降低趨勢(圖1a)；隨酶用量增加，DH和SS含量均呈幾乎線性增加(圖1b)；在30～70 ℃范圍內，DH和SS含量在60 ℃時達到最高，70 ℃時因高溫使酶部分失活而使DH和SS明顯降低(圖1c)；隨酶解時間延長，DH和SS含量均呈增加趨勢，在3～4 h后，增幅明顯減緩(圖1d)。出于酶解效率、蛋白溶解度和成本等方面考慮，確定木瓜蛋白酶對核桃蛋白的適宜酶解條件為：底物質量分數12%，酶用量1.0%，在60 ℃下水解4 h，在此條件下，核桃蛋白DH為3.09%，SS質量分數30%。

圖1 木瓜蛋白酶水解核桃蛋白的單因素實驗結果

2.2.2 菠蘿蛋白酶

圖2是底物濃度、酶濃度、酶解溫度和時間等因素對菠蘿蛋白酶水解核桃蛋白的影響趨勢。結果顯示，隨著底物濃度增加，核桃蛋白DH和SS含量均呈降低趨勢(圖2a)；隨酶用量增加，DH和SS含量均呈幾乎線性增加(圖2b)；在30～70 ℃范圍內，DH和SS含量在50 ℃時達到最高，此后因高溫使酶部分失活而使DH和SS明顯降低(圖2c)；隨酶解時間延長，DH和SS含量均呈增加趨勢，在3～4 h后，增幅明顯減緩(圖2d)。因此，綜合考慮后確定菠蘿蛋白酶適宜酶解條件為：底物質量分數12%，酶用量1.0%，在50 ℃下水解4 h。在此條件下，核桃蛋白DH為2.20%，SS質量分數25%。顯然，菠蘿蛋白酶對核桃蛋白的水解效果略遜于木瓜蛋白酶。這是因為菠蘿蛋白酶是一種高選擇性內切酶，優先水解堿性氨基酸(例如精氨酸)或芳香族氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸)的羧基側上的肽鏈[18-19]。

圖2 菠蘿蛋白酶水解核桃蛋白的單因素實驗結果

2.2.3 風味蛋白酶

底物濃度、酶濃度、酶解溫度和時間等對風味蛋白酶水解核桃蛋白的影響趨勢如圖3所示。結果顯示，隨著底物濃度的增加，核桃蛋白DH和SS含量均呈降低的趨勢(圖3a)；隨酶濃度增加，DH和SS含量均呈線性增加(圖3b)；在30～70 ℃范圍內，DH和SS含量在50 ℃時達到最高，此后因高溫使酶部分失活而使DH和SS明顯降低(圖3c)；隨著酶解時間延長，DH和SS含量均呈增加趨勢，在3～4 h后，增幅明顯減緩(圖3d)。因此，綜合考慮后確定風味蛋白酶的適宜酶解條件為：底物質量分數12%，酶用量1.0%，在60 ℃下水解4 h，在此條件下，核桃蛋白水解度為1.71%，可溶性固形物質量分數18.33%。

圖3 風味蛋白酶水解核桃蛋白的單因素實驗結果

單酶水解的因素分析結果顯示，在適宜的條件下，木瓜蛋白酶的酶解效果最好，其次是菠蘿蛋白酶，風味蛋白酶水解效果最差。這與各種酶的酶解特性有關。風味蛋白酶一般由米曲霉發酵制得，含有氨肽酶、羧肽酶，屬外切酶，通過末端水解多肽鍵，其水解產物多為游離氨基酸，一般用來改善酶解物風味[19-20]。就以上單酶水解結果而言，可溶性固形物最高也只有30%，相應水解度為2.20%。還不能達到核桃蛋白增溶改性目的。

2.3 核桃蛋白復合酶解

不同蛋白酶酶解位點不同，對蛋白質的水解效果也不同。因此，復合酶解理論上可以獲得比單酶更高的酶解效果[11]。三種蛋白酶不同組合下的酶解結果見表3。復合酶解中，除了酶用量有調整外，其他酶解條件為：底物質量分數12%、溫度50 ℃、酶解時間4 h。結果顯示，就SS而言，在總酶用量1.0%條件下，組合1>組合9>組合5。這表明，在核桃蛋白酶是水解中，①木瓜蛋白酶起主導作用，減少其用量，會降低核桃蛋白水解效果。在木瓜蛋白酶用量增加的情況下，核桃蛋白的DH和SS都有明顯增加(見表3)，該結果與上述單酶水解結果一致(圖1、圖2和圖3)。此外，相同酶用量下，酶組合①+②與①+③相比，后者的核桃蛋白雖然具有較高的 DH，但是SS卻低于前者。該結果與③風味蛋白酶的酶解特性有關：它是通過水解蛋白質分子末端肽鍵，其產物為游離氨基酸，所以對DH的影響較大，但是對SS的影響不大。

表3 不同酶組合對核桃蛋白的水解結果

注：表中①木瓜蛋白酶，②菠蘿蛋白酶，③風味蛋白酶。

表3中的組合13和組合12相比，增加了②菠蘿蛋白酶用量，核桃蛋白DH和SS不增反降(表3)，這似乎說明在三酶復合酶解體系中，存在競爭性水解：菠蘿蛋白酶用量的增加，抑制了木瓜蛋白酶的水解。是抑制了木瓜蛋白酶的活性，還是占據了木瓜蛋白酶的作用位點？具體抑制機理還需要進一步研究。從組合14-16可以看出，隨著③風味蛋白酶用量增加，DH雖有明顯增加，但SS增幅不大。這也進一步印證了③風味蛋白酶外切酶的酶解特性。

綜合表3結果，SS值最高的組合12(①1.2%+②0.4%+③0.2%)，相應的DH為5.57%，SS為48.33%；其次是組合4(①1.5%+②0.5%)，相應的DH為5.36%，SS為47.50%。采用這兩種酶組合制備的速溶核桃粉(IWF)中蛋白質質量分數83.26%，略低于DDWF中的86.84%，吸水性和吸油性得到顯著改善，分別提高了68.99%和52.48%(表1)；IWF中必需氨基酸質量分數11.77%，略高于DDWF中的11.11%(表2)，達到了DDWF增溶的目的。當然，若繼續增加復合酶解中酶的用量，酶解效果會更好，但是考慮到成本，酶用量一般不宜超過3%。

2.4 酶解雙指標的相關性分析

本研究中對于核桃蛋白水解效果的評價采用了水解度(DH，%)和可溶性固形物(SS，%)兩個指標。其中，DH是在蛋白質被催化水解時所裂解肽鍵數目的基礎上表示蛋白質水解情況其測定方法有：OPA 法、TNBS法、TCA法、pH- Stat、甲醛固定法、茚三酮比色法等多種，且不同方法間差異較大[15-16]。文中采用的是茚三酮比色法，為更加準確、便捷地評價核桃蛋白增溶效果，文中采用酶解液中可溶性固形物含量(SS，%)作為第二個評價指標。與DH相比，SS測定方法更簡便、快速和準確。

圖4和表4結果表明，4種酶解條件下，DH和SS間均呈現顯著的線性正相關，相關性最高的是菠蘿蛋白酶(R2=0.879 9)，其次是復合酶(R2=0.843 9)和木瓜蛋白酶(R2=0.757 0)，風味蛋白酶相關性最低(R2=0.638 5)。即便是相關性最低的風味蛋白酶，其相關性也已達到極顯著水平(P=0.000 1)。因此，文中采用DH和SS雙指標評價核桃蛋白酶法增溶效果是合適的。與DH測定相比，SS測定方法非常簡便、快速，可直接反映核桃蛋白的溶解性。

圖4 不同蛋白酶水解過程中DH與SS間的相關性

表4 不同蛋白酶水解過程中DH與SS間的相關性

3 結論

以核桃蛋白水解度(DH)和酶解液中可溶性固形物(SS)含量為指標，對木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶和風味蛋白酶等三種酶的單酶水解、復合酶解進行分析比較，得到核桃蛋白增溶改性適宜的酶解條件是：木瓜蛋白酶1.2%+菠蘿蛋白酶0.4%+風味蛋白酶0.2%，底物質量分數12%，50 ℃下酶解3 h。在此條件下所得速溶核桃粉DH為5.57%，SS為48.33%，其中蛋白質質量分數83.26%，吸水性和吸油性得到顯著改善，分別提高了68.99%和52.48%，達到了DDWF酶法增溶改性目的。

DH和SS間相關性分析結果表明，DH和SS間存在極顯著相關性。說明DH和SS雙指標評價核桃蛋白酶法增溶效果比DH單指標評價更加可靠，SS可與DH一起評價核桃蛋白的酶解效果或酶解程度。