胃腺癌組織中Livin與Survivin的表達及臨床意義

劉滿華

(咸寧市中心醫院 湖北科技學院附屬第一醫院綜合醫療科，湖北 咸寧 437000)

胃癌是消化系統最常見的惡性腫瘤之一〔1〕，僅2015年我國新增胃癌病例近68萬例，約50萬例因胃癌死亡〔2〕，預后差，其5年生存率僅為7%～34%〔3〕。胃癌的病理類型以胃腺癌最多見，手術切除、化療等傳統治療方法效果欠佳且難以治愈。多基因、多步驟、多因素共同參與腫瘤的發生、發展，細胞凋亡抑制和過度增殖是腫瘤形成的兩大主要機制。Livin和Survivin都屬于凋亡抑制蛋白家族(IAPs)中的成員〔4〕，可以直接或間接抑制凋亡信號轉導過程中的起始分子天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspases)-9及效應分子Caspase-3/-7的活性，起到抑制細胞凋亡的作用，在腫瘤的發生發展及預后中扮演重要角色。本實驗應用免疫組織化學方法檢測胃腺癌組織及正常胃組織中Livin及Survivin蛋白的表達情況，旨在探討二者在胃腺癌發生發展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集咸寧市中心醫院2013年6月至2017年8月胃腺癌手術切除標本56例為實驗組，其中男36例、女20例，年齡42～75歲，中位年齡63歲。患者均由病理診斷確診，術前未接受放療、化療和(或)免疫治療。按照國際抗癌聯盟(UICC)TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期22例，Ⅲ期24例，無Ⅳ期病例。伴有淋巴結轉移者38例，無淋巴結轉移者18例。組織學分級高分化3例，中分化14例，低分化29例，未分化10例。

正常胃黏膜組織56例為對照組，取自胃癌行胃切除的近側斷端胃黏膜，斷端距癌組織>5 cm，且組織學檢查顯示為正常胃黏膜。

1.2試劑 Livin兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶100)、Survivin兔抗人多克隆抗體(稀釋濃度1∶100)為武漢博士德生物工程有限公司產品，PV-6000免疫組化試劑盒和3，3′-二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑購自北京中杉金橋技術有限公司。

1.3方法 采用免疫組織化學PV-6000兩步法。標本離體后予10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋，制成4 μm厚的連續冷凍切片，二甲苯脫蠟至水化，蒸餾水沖洗，0.01 mol/L枸櫞酸液高壓抗原修復，2 min后自然冷卻至室溫，3%過氧化氫(H2O2)室溫孵育10 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2 min×3次。滴加一抗，4℃過夜，PBS沖洗2 min×3次，滴加生物素標記二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗2 min×3次，DAB顯色，蒸餾水沖洗，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.4評價指標 Livin、Survivin可表達于胞質和(或)細胞核。每張切片隨機選擇5個高倍視野，每高倍鏡視野均計數100個細胞，采用半定量積分法依據染色強度和陽性細胞百分率判斷染色結果。按陽性細胞百分率評分：無陽性細胞0分，陽性細胞百分率<10%1分，10%～49% 2分，50%～74% 3分，75%～100% 4分；按染色強度評分：無著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。兩項評分乘積≥3分判定為陽性，<3分判定為陰性。結果判定由2名有經驗的臨床病理醫師采用雙盲法認定。

1.5統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行χ2檢驗、Spearman等級相關性檢驗。

2 結 果

2.1兩組Livin及Survivin表達情況 實驗組29例(51.8%)Livin蛋白表達陽性；36例(64.3%)Survivin表達陽性，對照組有13例(23.2%)Livin蛋白表達陽性，Survivin表達陽性為15例(26.8%)。Livin與Survivin均主要出現在癌組織中，在間質細胞及臨近正常組織中則表達較少甚至不表達。實驗組Livin和Survivin蛋白陽性表達率明顯高于對照組(均P<0.01)。

2.2胃腺癌組織中Livin與Survivin表達的單因素分析 Livin和Survivin蛋白的表達與腫瘤TNM分期、浸潤深度及淋巴結轉移呈正相關(P<0.05)，與腫瘤的病理分化程度呈負相關(P<0.05)。兩者的表達與性別、年齡、腫瘤大小無關(P>0.05)，見表1。

表1 胃腺癌組織中Livin與Survivin陽性表達的單因素分析(n)

2.3胃腺癌組織中Livin與Survivin表達的關系 Livin蛋白表達陽性的29例胃腺癌組織中有24例Survivin蛋白表達陽性，27例Livin蛋白表達陰性的胃腺癌中有12例Survivin表達陽性，經Spearman等級相關性分析，Livin與Survivin的表達呈顯著正相關(r=0.371，P<0.01)。

3 討 論

凋亡具有獨特生物學和形態學特征，是細胞死亡的一種遺傳機制〔5〕。細胞凋亡是機體內重要的病理生理過程，在內環境穩定的維持、胚胎的形成和發育等方面扮演著極其重要的角色。凋亡抑制在腫瘤的形成中起著關鍵作用。

IAPs是一類獨立于Bcl-2的抗凋亡蛋白家族，對于目前已發現的其他凋亡抑制因子家族，IAPs抑制細胞凋亡的多樣性明顯較高〔6〕，近些年來備受人們關注。Livin和Survivin都隸屬于IAPs家族，Livin基因位于人類20號染色體q13.3，轉錄后可生成成熟的mRNA亞型：Livinα和Livinβ，盡管二者在基因編碼序列上相差18個氨基酸，但其功能在本質上并沒有差別。研究證明，Livin在多種人類惡性腫瘤中特異性高表達，如急性非淋巴細胞性白血病〔7〕、腎癌〔8〕、大腸癌〔9〕、食管癌〔10〕、肝癌〔11〕、前列腺癌〔12〕等，而相應的正常組織中的表達水平極低甚至不表達。Survivin基因亦是IAPs家族中的成員，在迄今發現的凋亡抑制因子中作用最強，不僅可以調節細胞有絲分裂促進細胞增殖，還具有抑制細胞凋亡的功能，在聯系細胞周期和細胞凋亡中起重要作用〔13〕。Survivin表達具有高度特異性，在終末分化的成人組織(胸腺、生殖腺除外)不表達，而高表達于胚胎和發育的胎兒組織和多種腫瘤組織中。

本研究結果顯示，Livin和Survivin在胃腺癌組織中的陽性表達高于正常胃組織。這與文獻報道一致〔14，15〕，由此推斷，Livin和Survivin在胃腺癌組織中高表達，可能參與胃腺癌的發生發展。本研究發現，Livin和Survivin兩種蛋白在胃腺癌組織中的表達與性別、發病年齡和腫瘤大小無相關性，但與腫瘤TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉移及病理分化程度均有關，這與兩者在其他腫瘤組織中的表達特點相似〔16〕。兩者與腫瘤轉移有密切關系，它們在胃腺癌組織中的高表達可能提示腫瘤具有強轉移能力及高侵襲性，推測這與二者具有促進腫瘤細胞增殖的功能有關。另外，本研究還發現，Livin和Survivin蛋白在胃腺癌組織中的表達率隨著腫瘤病理分化程度的增高而降低，提示Livin和Survivin兩種蛋白在腫瘤的發展過程中起重要作用，它們的表達強度影響腫瘤的惡性程度，有可能成為評價胃癌惡性程度的參考指標之一。

既往研究顯示，IAPs影響腫瘤細胞的生物學行為是通過改變細胞凋亡通路實現的〔17〕，目前的相關研究報道大多是抑制IAPs家族中的一種基因。本研究結果提示在胃腺癌中Livin與Survivin的在腫瘤組織中的高表達存在協同性，推斷，Livin和Survivin均為IAPs家族的成員，二者在結構上具有相似性，它們的協同表達很可能存在某種共同的信號轉導通路抑制細胞凋亡，這與文獻〔18〕所報道的在結腸癌中二者的表達具有協同性相似，但是，2種及2種以上基因相互影響的具體作用機制尚不明確，為提供更多的參考依據以證明多基因之間存在協同作用，還需要進一步在分子水平上研究。

綜上所述，Livin及Survivin在胃腺癌的發生發展過程中起重要作用。隨著研究的不斷深入，Livin及Survivin不但可能成為胃腺癌臨床診斷、判斷療效及監測預后的可靠指標，還可能為胃腺癌的靶向治療提供新位點。