降脂理肝湯對非酒精性脂肪肝大鼠脂代謝及TNF-α、MDA、APN水平的影響

韓靜 李亞偉 劉艷萍 劉宏

(1河北醫科大學第二醫院體檢中心,河北 石家莊 050000；2石家莊市第三醫院心內科)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)大部分患者無明顯癥狀，僅有少部分出現消化不良、乏力、肝脾腫大、肝區隱痛等非特異性癥狀〔1,2〕。NAFLD病情進展緩慢，但可直接導致失代償期肝硬化、肝細胞癌，并且可誘導2型糖尿病和動脈粥樣硬化的發生，影響患者的健康和生活質量〔3〕。目前NAFLD的具體發病機制尚無統一定論，“二次打擊”學說是認可度較高的一種理論，該學說認為胰島素抵抗(IR)導致肝細胞脂質蓄積為第一次打擊，在此基礎上發生的脂質過氧化等反應、氧化應激和炎癥反應可對肝細胞造成損傷，形成第二次打擊〔4～6〕。由此可見，脂代謝紊亂、氧化應激和炎癥反應是“二次打擊”學說中的重要步驟〔7〕。降脂理肝湯為張云鵬教授的臨床經驗方，臨床研究證明，降脂理肝湯治療NAFLD療效顯著，但其具體的作用機制尚未明確〔8〕。本研究通過觀察不同劑量的降脂理肝湯對NAFLD模型大鼠脂代謝指標、炎癥因子、氧化應激指標的影響，探討降脂理肝湯治療NAFLD的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級SD大鼠50只，購于長沙市天勤生物技術有限公司，合格證號：SCXK(湘)2009-0012。均為雄性，體重130～150 g，平均(142.24±4.36)g，飼養溫度22～24℃，相對濕度55%～65%，每天光照12 h，環境噪音≤85 dB。

1.1.2主要藥物和試劑 降脂理肝湯以澤瀉、丹參為主藥，成分為澤瀉10 g、丹參10 g、決明子30 g、海藻30 g、郁金10 g、荷葉10 g，藥材均來自河北醫科大學第二醫院藥房，配好藥方后進行煎煮，制成生藥濃度分別為0.46、0.92、1.84 g/ml的濃縮液。腫瘤壞死因子(TNF)-α、脂聯素(APN)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。

1.1.3主要儀器 石蠟切片機(德國萊卡公司，RM2235)，全自動生化分析儀(日立，7600)，倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯，ckx41)，全自動酶標生化儀(美國伯樂公司，680)。

1.2實驗方法

1.2.1動物分組 適應性喂養1 w后，采用隨機數字表法將大鼠分為正常對照組、模型對照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。

1.2.2造?！?〕及給藥方法 正常對照組采用基礎飼料喂養，其余大鼠采用高脂飼料喂養，高脂飼料配比：84%基礎飼料+14%豬油+2%膽固醇。均喂養8 w，期間所有大鼠自由活動，自由飲水。8 w后從高脂飼養的大鼠中每組隨機抽取1只，脫頸椎處死，取肝組織進行HE染色，根據病理圖片判定NAFLD模型大鼠是否造模成功。確定造模成功后，各組剩余的大鼠仍保持之前喂養的方式，并灌胃給藥。正常對照組和模型對照組大鼠給予生理鹽水5.5 mg/kg灌胃；低、中、高劑量組大鼠分別給予降脂理肝湯2.3、4.6、9.2 g生藥/kg體重灌胃。所有大鼠連續灌胃8 w。

1.2.3HE染色 脫頸椎處死大鼠后，取其肝臟，4℃冰浴滅菌生理鹽水沖洗，置于10%的甲醛緩沖液中固定24 h，常規脫水包埋后采用石蠟切片機進行連續切片，厚度約為5 μm。取切片，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中脫蠟處理，置于100%Ⅰ、100%Ⅱ、95%、80%、70%的酒精中進行水化處理，自來水沖洗2 min，蘇木素染色3 min，自來水沖洗2 min，1%鹽酸酒精分化30 s，自來水沖洗2 min，氨水反藍，自來水沖洗1 min，0.5%伊紅液染色3 min，自來水沖洗1 min，置于70%、80%、95%、100%Ⅰ、100%Ⅱ的酒精中進行脫水處理，二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.2.4大鼠的一般情況 在實驗過程中，觀察所有大鼠的精神狀況、活動情況、毛發光澤度、飲食情況、排泄情況和死亡情況等。

1.2.5血清學指標測定 連續灌胃給藥8 w后下腔靜脈采血5 ml，3 000 r/min離心10 min，取上層血清。采用全自動生化分析儀測定總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、游離脂肪酸(FFA)的水平。采用酶聯免疫吸附法檢測TNF-α、APN水平，具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.2.6肝勻漿指標測定 連續灌胃給藥8 w后，取肝組織1 g，加入生理鹽水10 ml，制備成10%的肝勻漿，采用酶聯免疫吸附法檢測肝勻漿中的SOD、MDA水平，具體操作步驟參考試劑盒說明書。

1.3統計學方法 采用SPSS20.0軟件，多組間計量資料比較采用F檢驗，兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1HE染色情況 正常對照組肝小葉保持完整的結構，肝細胞索整齊排列，肝細胞呈多邊形，核大而圓，無纖維組織增生。造模大鼠肝細胞排列無規律，伴氣球樣變，存在較明顯的炎性細胞浸潤，無肝纖維化及肝硬化。見圖1。

2.2各組大鼠一般情況 正常對照組大鼠精神狀況良好、活動頻繁、毛發有光澤、飲食正常、排泄正常、無死亡；模型對照組大鼠精神萎靡、較少活動、毛發油亮且部分大鼠背部毛發脫落、飲食正常、排泄正常、無死亡。低、中、高劑量組大鼠精神一般、時?；顒?、毛發油亮、飲食正常、排泄正常、無死亡。

2.3各組脂代謝情況 各組TC水平比較無統計學差異(P>0.05)；各組TG、LDL、FFA水平比較存在統計學差異(P<0.05)。模型對照組的TG、LDL、FFA明顯高于正常對照組(P<0.05)；高劑量組的TG、LDL、FFA明顯低于模型對照組和低劑量組(P<0.05)；中劑量組的TG明顯低于模型對照組和低劑量組，LDL明顯低于模型對照組，FFA明顯低于模型對照組、高于正常對照組(P<0.05)；低劑量組的TG、LDL、FFA明顯低于模型對照組、高于正常對照組(P<0.05)。見表1。

圖1 典型樣本病理改變(×400)

2.4各組TNF-α、APN水平比較 各組TNF-α、APN水平存在統計學差異(P<0.05)。模型對照組的TNF-α明顯高于正常對照組，APN明顯低于正常對照組(P<0.05)；高劑量組的TNF-α明顯低于模型對照組，APN明顯高于中、低劑量組、模型對照組(P<0.05)；中劑量組的TNF-α明顯低于模型對照組(P<0.05)，APN明顯高于低劑量組、模型對照組，低于正常對照組(P<0.05)；低劑量組的TNF-α明顯低于模型對照組(P<0.05)，APN明顯高于模型對照組、低于正常對照組(P<0.05)。見表1。

2.5各組SOD、MDA水平比較 各組SOD、MDA水平存在統計學差異(P<0.05)。模型對照組的SOD明顯低于正常對照組，MDA明顯高于正常對照組(P<0.05)；高、中劑量組的SOD明顯高于低劑量組、模型對照組，低于正常對照組(P<0.05)，MDA明顯低于模型對照組(P<0.05)；低劑量組的SOD明顯高于模型對照組、低于正常對照組(P<0.05)，MDA明顯低于模型對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組脂代謝情況、TNF-α、APN、SOD、MDA水平比較

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型對照組比較：2)P<0.05；與中劑量組比較：3)P<0.05；與低劑量組比較：4)P<0.05

3 討 論

隨著代謝綜合征和肥胖癥在全球的流行，NAFLD的患病率明顯上升，成為全世界重要的公共衛生問題〔10〕。西藥治療NAFLD療效單一，且存在不同毒性和不良反應，近年來中醫治療NAFLD的相關研究顯著增多，散瘀化濁湯、降脂理肝湯等中藥湯劑在臨床上也取得了較好的療效〔11〕。祖國醫學認為NAFLD屬于“積證”、“痰證”、“脅痛”、“肥氣病”等范疇。NAFLD是肝虛、脾虛、腎虛為本，而痰濁瘀血為標的病證，在疾病前期多由于過食肥甘厚味、情志失調、勞逸失度或久病體虛導致肝失疏泄、肝郁氣滯、腎陽虧虛、脾失健運，進而導致瘀血阻滯、脂濁積聚，痹阻于肝臟脈絡，氣血痰瘀互結于脅下，日久肝臟受損〔12,13〕。NAFLD在中醫學上可分為肝郁脾虛證、痰濕內阻證、氣滯血瘀證、濕熱內蘊證、肝陰不足證，其治療思路為補益肝腎、疏肝健脾、化瘀通絡、祛痰泄濁、益氣養陰〔14〕。

本研究結果說明NAFLD模型大鼠存在明顯的脂代謝紊亂，而降脂理肝湯可改善NAFLD模型大鼠的脂代謝水平，且中劑量和高劑量的療效更顯著。

降脂理肝湯主要由澤瀉、丹參、決明子、海藻、郁金、荷葉等六味中藥組成，方中澤瀉、丹參為主藥，其中澤瀉利濕降濁、健脾寧心，丹參活血化瘀、清心除煩；決明子、海藻為輔藥，決明子清肝明目、潤腸通便，海藻利水清熱、消痰軟堅；郁金為佐藥，具有通絡止痛、行氣化瘀的功效，并可與丹參藥性結合，起到疏理肝絡、活血化瘀、消除脅痛的作用；荷葉為使藥，具有升清降濁、散瘀祛濕的作用。諸藥聯合共奏補益肝腎、疏肝健脾、氣行郁解、痰化濁降、血活瘀消之功效〔15,16〕。

APN是一種胰島素增敏激素，可激活腺苷酸活化蛋白激酶、抑制Toll樣受體4介導的通路，進而增強胰島素敏感性，改善IR。TNF-α為“二次打擊”學說中的重要炎性因子，主要由單核細胞、巨噬細胞、脂肪細胞分泌，可誘導產生多種炎性因子，級聯放大炎癥反應，促進氧化應激，在NAFLD的發展中起到重要作用。SOD是氧自由基的自然天敵，是生物體內重要的抗氧化酶，能將體內的超氧自由基轉化為過氧化氫，過氧化氫再進一步反應轉化為水。MDA是氧化終產物，其水平能反映氧化應激程度，且MDA能引起蛋白質、核酸等生命大分子交聯聚合，具有一定的細胞毒性〔17,18〕。本研究結果顯示，NAFLD模型大鼠APN水平明顯下降，且存在明顯的炎癥反應和氧化應激，而降脂理肝湯可改善NAFLD模型大鼠APN水平，降低炎癥反應和氧化應激，這可能是降脂理肝湯治療NAFLD的機制之一。