臨床分離鮑曼不動桿菌耐藥分布及其碳青霉烯類耐藥基因研究

張薇娜，楊正海，張鵬*

（1.蕪湖市中醫醫院檢驗科，安徽 蕪湖 241001；2.皖南醫學院弋磯山醫院檢驗科）

鮑曼不動桿菌為非發酵革蘭陰性桿菌，屬于條件致病菌。該菌是醫院感染的重要病原菌，主要引起呼吸道感染，亦可引發菌血癥、泌尿系統感染、繼發性神經系統感染、呼吸機相關肺炎等［1］。近年來隨著抗生素的廣泛使用，各類細菌總體耐藥率在逐年上升［2］，尤其多重耐藥菌株的出現，增加了臨床抗菌治療的難度。鮑曼不動桿菌在醫院環境中分布廣泛且長期存活，極易造成危重患者感染，且住院患者之間的高流動性，加速了病原菌的傳播和蔓延，及時監測病原菌的耐藥總體情況對于醫源性感染的爆發和菌株耐藥發展顯得十分重要［3］。本研究對我院2018年住院患者感染的鮑曼不動桿菌進行耐藥分布和耐藥基因檢測，以期為臨床合理用藥和醫院感染控制提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象 嚴格按照微生物標本的采集規范，收集2018年1至12月蕪湖市中醫醫院住院患者痰液標本。

1.2 細菌鑒定和藥敏試驗 所有菌株經培養分純后均采用法國bioMerieux VITEK-2全自動微生物鑒定儀進行菌株鑒定，細菌鑒定卡批號（2410667203），質控菌株采用衛生部臨檢中心提供的大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923。受試菌株經確認為鮑曼不動桿菌后采用最小抑菌濃度（MIC）測定方法進行藥敏試驗，細菌藥敏卡批號（1100868203）。細菌鑒定和藥敏試驗步驟嚴格按照儀器使用說明書操作，結果按臨床和實驗室標準協會（CLSI）2017、2018抗微生物藥物敏感性試驗的執行標準判讀。

1.3 耐藥基因擴增 使用美國Bio-Rad Mycycler梯度PCR儀擴增鮑曼不動桿菌耐藥基因，4對引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。20 μl反應體系：dNTP 1 μl，10×buffer 2 μl，Taq 酶 0.5 μl，上下游引物各 1 μl，DNA 模板 2 μl，去離子水 13.5 μl。擴增程序：94 ℃ 5 min，94 ℃30 s，58 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共循環35次，72 ℃ 10 min，4℃保存。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳分離，經DNA marker對照確認。

表1 PCR引物序列

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，計數資料比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 鮑曼不動桿菌的來源及耐藥分布 臨床分離鮑曼不動桿菌共68株，重癥醫學科檢出率最高，其次為腫瘤科和呼吸內科，鮑曼不動桿菌在不同科室的感染檢出率構成見表2。68株鮑曼不動桿菌對常見藥物氨曲南、頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、左氧氟沙星、頭孢替坦、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、亞胺培南耐藥率分別為95.59%、48.53%、48.53%、48.53%、25.00%、95.59%、100%、48.53%、48.53%，見表3。

表2 2018年蕪湖市中醫醫院鮑曼不動桿菌來源科室

表3 2018年蕪湖市中醫醫院鮑曼不動桿菌對常見抗菌藥物的耐藥率（%）

2.2 碳青霉烯類耐藥基因檢測 33株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌中OXA-23陽性25株（75.8%）、OXA-24陽性0株（0%）、OXA-51陽性33株（100%）、OXA-58陽性0株（0%），電泳結果見圖1。將鮑曼不動桿菌分為耐碳青霉烯類組（CRAB）和敏感組（CSAB），耐藥基因檢測結果對比見表4，發現耐藥基因OXA-23在2組比較中差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 部分菌株4種OXA酶基因PCR產物

表4 CRAB與CSAB對OXA耐藥基因的相關性分析

3 討論

鮑曼不動桿菌分布廣泛，主要存在于水體和土壤等潮濕環境中，該菌粘附力極強，可定植于正常人體皮膚、咽部、胃腸道等分泌物中，致病易感人群為老年患者、新生兒、手術創傷、氣管切開、廣譜抗菌藥物或免疫抑制劑應用者，目前已是引發院內感染的重要致病菌［4］。碳青霉烯類藥物可通過抑制細菌細胞壁合成促使細胞死亡，因此是治療鮑曼不動桿菌的常用抗生素之一，然而由于臨床抗生素的不合理使用，致使耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌數量逐年增高［5］，臨床針對鮑曼不動桿菌的抗菌治療一直是難題。根據2017年全國細菌耐藥監測報告顯示，鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類藥物的耐藥率全國平均水平為56.1%，安徽高達68.1%［6］，耐藥情況十分嚴峻。

鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類藥物原因主要是產耐碳青霉烯酶，該酶根據Ambler分類法可分為3類：A類（絲氨酸蛋白酶）、B類（金屬酶）、D類（苯唑西林酶），鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯酶主要為B、D兩類酶，尤以D類酶能夠水解頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素而致菌株多重耐藥。本研究結果顯示，鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的耐藥分布與之前相關報道一致，即該菌對大多數抗生素呈現耐藥［7-8］。耐藥機制方面，研究表明OXA-51是鮑曼不動桿菌天然存在的苯唑西林酶基因，種屬特異性較高［9］，此外OXA-23、OXA-24、OXA-58等常見耐藥基因也有檢出［10-12］。本研究結果顯示，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌OXA基因主要是OXA-23和OXA-51型，檢出率分別為75.8%和100%，而碳青霉烯類敏感鮑曼不動桿菌OXA基因主要是OXA-51型，檢出率也為100%，經統計學分析提示OXA-23型是我院引起鮑曼不動桿菌耐藥的主要因素，OXA-24有報道主要發現于歐洲德國、西班牙等地區［13］，本研究尚未發現有OXA-24型，且該型菌株同源性有待進一步研究。除碳青霉烯類藥物以外，鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類、喹諾酮類等其他藥物耐藥率也較高，與氨基糖苷類修飾酶、16S rRNA甲基化酶［14］及gyrA、parC基因突變［15］有關。鑒于鮑曼不動桿菌的高耐藥率，近年來頭孢哌酮/舒巴坦、替加環素、多黏菌素應用于臨床藥敏試驗，且耐藥率不高［16］，可以考慮為耐碳青霉烯類革蘭陰性桿菌治療的良好選擇［17］，合理使用并加以推廣。鮑曼不動桿菌耐藥機制復雜，本研究雖然發現碳青霉烯類耐藥基因型主要是OXA-23和OXA-51型，但其他耐藥機制如產金屬酶［18］、ISAbla片段插入［19］、主動外排泵等有待進一步研究，且菌株來源時間僅為一年，沒有該菌在時間上的縱向比較結果和耐藥發展趨勢，今后可繼續開展此項研究指導臨床合理用藥和院內感染監控。

綜上所述，我院鮑曼不動桿菌主要分布于重癥醫學科和腫瘤科，且耐藥情況十分嚴重，醫院應強化抗菌藥物分級使用的管理，減緩多重耐藥菌株的產生，必要時可聯合替加環素、多黏菌素等新型抗菌藥物進行治療［20-21］，院內感染方面應嚴格執行手衛生規范，做好多重耐藥菌的隔離防護措施，清潔工作環境并加強耐藥菌篩查，阻止多重耐藥鮑曼不動桿菌在醫院的定植和傳播。