2種烷基多環芳烴對仿刺參CYP450和p53基因表達的影響研究

李香，魏海峰1,,*，劉長發，宋雪，趙肖依，趙雨朦，夏寧，霍玉潔

1. 大連海洋大學，農業農村部北方海水增養殖重點實驗室，大連 116023 2. 大連海洋大學，海洋科技與環境學院，大連 116023 3. 大連海洋大學，近岸海洋環境科學與技術遼寧省高校重點實驗室，大連 116023

近年來由于突發海洋溢油事故和沿海石油化工業的發展，大量石油烴類污染物通過各種途徑進入海洋中，成為潛在的危害我國海洋生態環境安全的重要因素之一。石油毒性主要來源于其中的多環芳烴(PAHs)組分，多環芳烴類約占石油組分的1%～6%，其中80%～90%為烷基化多環芳烴[1]。前期國內外大量研究多關注16種優先控制的多環芳烴，而對多環芳烴的衍生物關注極少，這可能導致由多環芳烴衍生物造成的生態風險被低估[2]。菲和蒽是最具代表性的三環多環芳烴，在石油中含量較高，關于其毒性的研究報道較多[3-4]。3-甲基菲和2-甲基蒽是菲和蒽的烷基化衍生物，國內外關于這2種衍生物毒性的報道較少，有必要對其毒性效應進行研究。

細胞色素P450(Cytochrome P450, CYP450)和p53基因都是常用的分子生物標志物，它們均在外源物質的代謝和解毒方面起重要作用[5-6]。CYP450是生物體內含有多種超家族CYP450血紅蛋白或相同結構域的酶系，對許多外源及內源化合物在生物體內的生物轉化具有重要的作用[7]。環境中的有機污染物進入生物體內后，可誘導或抑制細胞色素P450酶系CYP活力顯著增加或降低，利用生物代謝過程中CYP含量或活力與污染物毒性之間的響應關系,可將CYP450作為毒物毒性的生物標記物,進行環境污染的早期診斷。但由于大多數P450酶的含量很低且不穩定,直接分離純化P450酶非常困難，因此在克隆P450基因的基礎上,研究多環芳烴類污染物對CYP450基因表達的影響[8-9]。抑癌基因p53在細胞凋亡中起著重要作用，DNA損傷以及不正常的細胞增殖信號都會引起P53蛋白的激活[10],由于其功能的多樣性及與腫瘤發生的高度相關性，研究環境有毒化合物對p53基因的損失對闡明化合物遺傳毒作用、分子機制以及風險評價具有重要的科學意義[6]。

仿刺參(Apostichopusjaponicus)是黃、渤海重要底棲生物類群，主要攝食底泥中細菌、底棲硅藻和有機質碎屑[11]。作為我國重要海水增養殖品種之一，其生物學數據基本完備、并且取材方便，是海洋環境污染物生物毒性評價的理想受試生物[12]。林芳等[13]和靳非等[2]分別進行了多環芳烴類污染物對翡翠貽貝(Pernaviridis)胚胎和河鲀(Takifugurubripes)幼魚的毒理學研究。相比貝類、魚類而言，國內外對于多環芳烴類污染物對海參的毒理學效應研究較少。因此，本文選擇仿刺參(A.japonicus)為受試生物，設置3種不同濃度的3-甲基菲和2-甲基蒽處理健康仿刺參，檢測其體內CYP450和p53基因的相對表達量，分析仿刺參CYP450和p53基因的表達與3-甲基菲和2-甲基蒽的劑量-效應關系和時間-毒性效應關系，為開展2種多環芳烴污染物對海洋生物毒性評價篩選敏感標志物。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：Nano Photometer微量核酸蛋白分析儀(德國Implen)，CT15RE型臺式微量高速離心機(日本Hitachi)，Mx3005pTM實時熒光定量PCR儀(美國Stratagene)，ZHWY-200D恒溫搖床(上海世平實驗設備有限公司)。

試劑：2-甲基蒽和3-甲基菲購自Sigma公司(Sigma-Aldrich Corporation, USA)，純度分別大于97%和98%；丙酮(分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司)，Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，上海)，PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)，SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit II(TaKaRa)。

1.2 實驗材料

實驗用海水取自大連黑石礁海域的砂濾海水，仿刺參(A.japonicus)的幼參購自大連太平洋海珍品有限公司，體長(水中)為(2±0.3) cm，經清潔海水馴養2周后，選取健康幼參用于后續實驗。

1.3 多環芳烴毒性實驗

用1 L玻璃燒杯洗凈后裝入海水，加入一定濃度3-甲基菲和2-甲基蒽儲備液，設置3-甲基菲濃度分別為5 μg·L-1、10 μg·L-1和100 μg·L-1，2-甲基蒽濃度分別為5 μg·L-1、10 μg·L-1和50 μg·L-1，同時設置海水對照組和丙酮對照組，各處理組設置3個平行，每個燒杯中放入10只幼參。試驗條件：水溫(15±2) ℃，鹽度(30±1)，pH (8.0±0.5)，間斷性充氧，確保溶解氧大于4.5 mg·L-1，避光。

1.4 樣品采集及RNA提取

3-甲基菲和2-甲基蒽處理3 d、7 d、14 d后，取各處理組幼參一只放于冰上，用移液槍抽取海參體液，裝入tube管中迅速投入準備好的液氮中，-80 ℃保存。Trizol法提取上述樣品的總RNA，DNase I進行DNA消化處理，微量核酸蛋白分析儀檢測總RNA的濃度和純度，Agilent 2100生物分析儀檢測RNA完整性。

1.5 基因表達水平測定

分別取上述樣品總RNA用Prime-ScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)進行反轉錄。使用Mx3005pTM實時熒光定量PCR儀，采用SYBR Prime-ScriptTMRT-PCR Kit II進行實時定量PCR。以β-Actin作內參，相關基因擴增引物名稱及其序列見表1。

反應條件：95 ℃，30 s；95 ℃，10 s；55 ℃，25 s；72 ℃，25 s，40個循環。利用delta-delta Ct法，通過仿刺參的內標基因AB510191.1(Actin)的校正，對仿刺參樣品中CYP450和p53基因表達量進行分析。

1.6 數據統計與處理

試驗數據用平均值±標準誤差(mean±S.D.)表示，使用SPSS 22.0統計軟件對所得數據進行統計學分析，采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan新復極差法對數據進行差異性分析。設置P<0.05時，表示差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 3-甲基菲、2-甲基蒽對仿刺參CYP450基因表達的影響

3-甲基菲和2-甲基蒽對仿刺參CYP450基因表達的影響如圖1所示。結果表明，與對照組相比，3-甲基菲(c≥5 μg·L-1)和2-甲基蒽(c≥10 μg·L-1)在一定濃度脅迫下，對仿刺參CYP450基因的表達均表現出顯著的抑制作用(P<0.05)。2-甲基蒽在濃度5 μg·L-1脅迫14 d后，對CYP450基因的表達有顯著的誘導作用(P<0.05)。隨著時間增加，海水對照組CYP450基因的相對表達量無明顯變化，丙酮對照組CYP450基因的相對表達量不斷增大，說明丙酮促進了仿刺參CYP450基因的表達。與對照組相比，3-甲基菲暴露14 d后，CYP450基因的整體相對表達量小于對照組，差異顯著(P<0.05)，隨著濃度的升高，CYP450基因的相對表達量逐漸增大，100 μg·L-1處理組與10 μg·L-1處理組相比，差異不顯著(P>0.05)。用2-甲基蒽暴露14 d后，隨著濃度的升高CYP450基因的表達量受到明顯的抑制，且存在一定的劑量-效應關系(P<0.05)。連續暴露14 d后，仿刺參CYP450基因相對表達量在3-甲基菲濃度為5 μg·L-1脅迫下達到最小值0.21，在2-甲基蒽濃度為50 μg·L-1脅迫下達到最小值0.16。

表1 相關基因擴增引物名稱及其序列Table 1 Name and sequence of the target gene amplified with primers

圖1 3-甲基菲、2-甲基蒽對仿刺參CYP450基因表達的影響注：標有不同小寫字母者表示顯著性差異(P<0.05)，標有相同小寫字母者表示無顯著性差異(P>0.05)，圖表橫坐標中B表示空白對照組，B-B表示溶劑對照組，下同。Fig. 1 The effects of 3-methylphenanthrene, 2-methylanthracene on the CYP450 gene expression of Apostichopus japonicusNote: The different letters mean significant differences at the 0.05 probability level, and the same letters mean no significant differences; B represents the seawater control group and B-B represents the acetone control group.

圖2 3-甲基菲、2-甲基蒽對仿刺參p53基因表達的影響Fig. 2 The effects of 3-methylphenanthrene, 2-methylanthracene on the p53 gene expression of Apostichopus japonicus

2.2 3-甲基菲、2-甲基蒽對仿刺參p53基因表達的影響

3-甲基菲和2-甲基蒽仿刺參p53基因表達的影響如圖2所示。3-甲基菲和2-甲基蒽脅迫初期(3 d)對仿刺參p53基因的相對表達量表現出規律不一致的變化，與對照組相比，3-甲基菲各處理組對仿刺參p53基因的表達均表現出顯著的抑制作用(P<0.05)，且隨著脅迫濃度的升高，抑制作用逐漸減小，存在明顯的劑量-效應關系，2-甲基蒽各處理組對仿刺參p53基因的表達也均表現出顯著的抑制作用(P<0.05)，但隨著脅迫濃度的升高，抑制作用逐漸增大。3-甲基菲脅迫中期(7 d)，隨著脅迫濃度的升高，仿刺參p53基因的相對表達量表現出先升高后降低的規律，2-甲基蒽脅迫中期(7 d)，各處理組對仿刺參p53基因的表達均表現出誘導作用，且隨著脅迫濃度的升高，仿刺參p53基因的相對表達量表現出與3-甲基菲脅迫相似的規律，也呈先升高后降低的趨勢。3-甲基菲和2-甲基蒽脅迫后期(14 d)，與對照組相比，各處理組均對仿刺參p53基因的表達表現出顯著的抑制作用(P<0.05)，且均在脅迫濃度為10 μg·L-1時仿刺參p53基因的相對表達量達到最小值。

3 討論(Discussion)

CYP450和p53基因的表達在3-甲基菲和2-甲基蒽污染物脅迫下整體上均表現出抑制作用，說明在外源污染物進入仿刺參體內時，CYP450和p53基因的表達均能對毒物產生響應以維持仿刺參正常的生理活動，但二者的具體響應程度及對2種污染物的耐受閾值存在差異，這可能與CYP450基因和p53基因在生物體內的主要功能及作用機制不同有關。不同的外源化學物質進入生物體內后可引起氧化應激、基因毒性應激和蛋白質毒性應激等反應，從而激活生物細胞內解毒代謝系統，以維持生物體內環境的相對穩定[14]。而檢測參與這些反應的各種解毒代謝酶類的響應變化可部分反映外源污染物對生物的影響。環境污染物進入生物體內后，通常會在P450酶系的參與下，進行氧化、還原、水解等代謝過程，使得污染物極性增加，導致污染物的毒性減弱[15]。海洋無脊椎動物在有機污染物的I相代謝過程中產生大量副產物——活性氧，過量的活性氧會導致生物體的氧化損傷[16-19]。CYP450酶系作為生物體內的第一代謝階段酶,它通常將分子氧拆分成原子氧，并將其加入到底物中促使底物羥基化或環氧化，為第二階段的谷胱甘肽轉移酶(GST)對外源物的轉化提供基礎[20]。在本實驗中，仿刺參CYP450基因的表達在3-甲基菲脅迫時受到抑制，在2-甲基蒽脅迫3 d和7 d后均受到抑制，而脅迫14 d后表現出顯著的誘導作用(P<0.05)。因此，仿刺參CYP450基因的表達在不同多環芳烴脅迫下表現出不一致的變化規律。這與菲和3-甲基菲等對河鲀(Takifugurubripes)幼魚肝組織損傷的影響及多環芳烴類物質對CYP450 1A1的誘導表達表現出相似的規律[2,21]。因此，推測短時間內(7 d)2-甲基蒽誘導仿刺參CYP450基因的表達，調動相關酶來抵抗毒性物質的毒性作用，降低或減輕細胞的應激反應，但其調節能力有限，CYP450基因的表達不可能無限提高，當隨著染毒時間的延長(14 d)，仿刺參受到的毒性作用超出其耐受性，其CYP450的合成體系受到損傷，使得CYP450基因的相對表達量下降，表現出中毒效應。而CYP450基因對3-甲基菲的耐受能力較強，在染毒期間持續表現為誘導作用。因此，多環芳烴類污染物3-甲基菲對仿刺參CYP450基因表達的影響小于2-甲基蒽。

p53基因是化學誘變物的主要攻擊位點，p53基因突變后，失去了對細胞生長、凋亡和DNA修復的調控作用。p53不僅本身參與機體DNA損傷的修復過程，它還作為多種細胞應激于細胞應答的中間環節，與其上下游的各種調控因子及其相關基因共同構成了調控細胞應激和細胞應答的復雜網絡[22]。在本實驗中，仿刺參p53基因的表達在3-甲基菲脅迫時受到了抑制，在2-甲基蒽脅迫7 d時表現出顯著的誘導作用(P<0.05)，而后(14 d)表現出顯著的抑制作用。正常組織中p53的表達水平很低,當生物受到外界脅迫時，p53的表達水平明顯增加[23]。有研究報道，納米二氧化硅包被氧化錳能誘導Hela細胞和L929細胞中p53基因表達量升高[24]。因此推測，3-甲基菲在低濃度(c≤100 μg·L-1)短時間(t≤14 d)脅迫時沒有對仿刺參造成較強的毒害作用，而2-甲基蒽脅迫長時間(7 d)時對仿刺參產生嚴重的毒害作用，且仿刺參p53基因對2-甲基蒽脅迫時間有一定的耐受閾值，當脅迫時間大于此閾值后，可能導致細胞損傷或死亡，致使p53基因相對表達量減少。

比較2種多環芳烴類污染物對仿刺參CYP450和p53基因的相對表達量發現，在相同濃度和時間脅迫下，2種物質對仿刺參CYP450和p53基因表達的影響作用總體趨勢為3-甲基菲<2-甲基蒽，這可能意味著由于二者結構和性質的差異導致其作用機制不同。除濃度和時間外，化合物的結構可能對其毒性有重要影響，需進一步進行相關研究。

致謝：感謝大連海洋大學徐光景博士在文章修改中給予的幫助。