響應面優化酸性染料法測定走馬胎總生物堿含量條件*

周澤建

(1.中央民族大學 生命與環境科學學院，北京100081;2.廣西生態工程職業技術學院，廣西 柳州545004)

0 引言

走馬胎Ardisia gigantifolia Stapf為紫金牛科紫金牛屬，是一種珍貴的民族藥用植物.它具有祛風濕、活血止痛、生肌化毒、壯筋活絡等功效，主要用于風濕骨痛、跌打損傷、痛經等南方常見疾病的治療.[1]現代藥理研究表明，走馬胎具有抗腫瘤、抗氧化、抗血栓等生物活性.[1]走馬胎的活性成分主要有多糖、三萜皂苷類、生物堿.[2]定量測定生物堿的含量有很多種方法，如滴定法、[3]酸性染料法、[4]薄層色譜分析法、[5-7]高效液相色譜分析法、[8]酶聯免疫分析法、[9]儀器聯用分析法、[10]高效毛細管電泳分析法[11]及近紅外光譜分析法.[12]其中，酸性染料法具有簡單易操作、結果可靠、重復性好等優點，被廣泛應用于總生物堿含量的測定.相關文獻研究結果表明，影響酸性染料法的因素主要有酸性染料用量、酸性染料p H值、靜置時間.[2，13-15]因此，本研究對酸性染料用量、酸性染料p H值、靜置時間進行考察，考察其對生物堿吸光度值的影響，在單因素實驗的基礎上，采用響應面優化酸性染料法的測定條件，為走馬胎質量控制方法提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

走馬胎采自廣西生態工程職業技術學院溫室大棚，洗凈、晾干后，在60℃下烘干至恒重，粉碎，過200目篩子備用.

1.2 實驗試劑

無水乙醇、硫酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、溴甲酚綠、氯仿均為國產分析純;氧化苦參堿對照品(編號：GR0837)購自南京廣潤生物制品有限公司.

1.3 實驗儀器

AUW-D型電子分析天平(日本島津);IKA旋轉蒸發儀(德國IKA公司);恒溫水浴鍋(常州儀器制造公司);低溫冷凍超速離心機(日本日立公司);紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司).

1.4 實驗方法

1.4.1 走馬胎總生物堿提取液的制備

精密稱取走馬胎2 g，加20倍90%乙醇，加熱回流提取2 h，過濾得濾液，經旋轉蒸發儀濃縮成浸膏.浸膏用2%硫酸溶解，合并酸水溶液，離心得上清液.上清液以5 mol.L-1氫氧化鈉溶液調節p H值至9～10，等體積氯仿萃取三次.合并萃取液，濃縮至10 ml，備用.

1.4.2 試劑的配制

準確稱取氧化苦參堿對照品7.3 mg，用無水乙醇溶解后定容至50 ml，配成0.146 mg.ml-1標準溶液，存4℃冰箱備用;精密稱取磷酸二氫鉀6.8045 g和氫氧化鈉1.6880 g，溶于超純水后定容至1000 ml，配成p H值大約等于7.6的磷酸緩沖液.準確稱取溴甲酚綠0.1000 g，用磷酸緩沖液超聲溶解后定容至200 ml，配成酸性染料溶液.

1.4.3 測定方法

精密吸取氧化苦參堿標準溶液0.6 ml，揮干后加入適量、適宜的p H值酸性染料，振搖1 min，然后加入氯仿10 ml置于分液漏斗中，振搖1 min后靜置適當的時間，取氯仿層加入0.2 g的無水硫酸鈉，同時以試劑作為空白，于400 nm處測定其的吸光度值.

1.4.4 顯色條件的單因素實驗

影響酸性染料法測定總生物堿的主要因素有酸性染料用量、酸性染料p H值、靜置時間等.因此，本文采用單因素實驗，分別考察此3個因素對走馬胎總生物堿測定的影響.吸光度值按1.4.3測定.

1.4.5 響應面實驗設計

基于單因素實驗結果，根據Box-Behnken Design(BBD)設計原理，選取酸性染料用量、酸性染料p H值、萃取時間作為三個因素變量，對此三個因素進行三因素三水平響應面設計，以吸光值為響應值，各因素的三水平用-1、0、1進行編碼，[16]如表1.

1.4.6 精密度實驗

精密吸取供試樣品溶液0.8 ml 5份，按照1.4.5得出的最優條件進行顯色實驗，于400 nm處測定吸光度值.計算其結果的RSD值.

1.4.7 穩定性實驗

精密吸取供試樣品溶液0.8 ml，按照響應面優化的顯色條件進行顯色實驗，于400 nm處測定吸光度值.每隔0.5 h測定1次，共測5次.計算其結果的RSD值.

1.4.8 重復性實驗

精確稱取同一批走馬胎2.00 g 5份，按照1.4.1制備供試樣品溶液.采用響應面優化的顯色條件，按照1.4.3法測定供試樣品溶液的吸光度.計算其結果的RSD值.

1.4.9 標準曲線的繪制

依次精密吸取氧化苦參堿標準溶液0.10 ml、0.20 ml、0.40 ml、0.60 ml、0.80 ml、1.00 ml，揮干后采用響應面優化的顯色條件，按照1.4.3法測定標準品溶液的吸光度.以吸光度為縱坐標，標準品溶液中氧化苦參堿含量為橫坐標進行標準曲線的繪制.

1.4.10 樣品測定與加標回收實驗

從1.4.1制備的備用液精確量取0.40 ml 11份，前5份不加氧化苦參堿標準溶液，其余6份加標準溶液0.20 ml，揮干后采用響應面優化的顯色條件，按照1.4.3法測定溶液的吸光度.計算其回收率.

表1 響應面設計水平與編碼Tab.1 Independent variables and their levels used in the response surface design

1.5 數據處理

實驗數據經Excel預處理后，運用Design-Expert 7.0軟件進行方差分析，采用SPSS 19.0軟件進行描述性統計分析.

2 結果與分析

2.1 測定波長的確定

在300～500 nm之間，對樣品和對照品溶液進行光譜掃描.掃描結果如圖1所示，樣品和對照品溶液都在400 nm處有最大吸收峰.因此，選擇400 nm為測定波長.

圖1 光譜掃描圖Fig.1 UV-visible spectrum chromagrams

2.2 單因素實驗

2.2.1 酸性染料用量對吸光度的影響

由圖2中C可以看出，除了酸性染料用量5 ml外，隨著其用量的增加，樣品吸光度逐漸增大，在用量為7 ml處達到最大，此后逐漸減少.因此，選擇酸性染料用量7 ml為最佳比色條件.

2.2.2 p H值對吸光度的影響

樣品吸光度隨著p H值的增大而增大，在p H=7.6時達到最大(圖2中B).因此，p H值確定為7.6左右.

2.2.3 靜置時間對吸光度的影響

圖2 三種因素對吸光度的影響Fig.2 Effect of acid dosage，p H and standing time on sample's absorbance

由圖2中A得出，隨著靜置時間的增加，樣品吸光度出現先增加后減少的現象，在靜置時間為1.5 h處出現峰值.因此，靜置時間定為1.5 h左右.

2.3 響應面實驗結果分析

2.3.1 模型的建立與檢驗

以吸光度為響應值，采用Design-Expert 7.0軟件對表2結果進行ANOVA分析，得出結果如表3所示.對表3所示的系數進行多元化擬合回歸，得回歸方程如下：

表2 走馬胎生物堿響應面設計與實驗結果Tab.2 Response surface design matrix with experimental and predicted values of total alkaloid content of Ardisia gigantifolia Stapf

表3 回歸方程的方差分析表Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model analysis of variance table

所得模型具有極顯著(p＜0.01)，相關系數R2為0.9717，調整相關系數R2adj為0.9208，變異系數CV＜10%，并且模型失擬不顯著(p＞0.05)(表3).這些數據充分證明該模型顯著，所獲得的二次回歸方程在酸性染料法測定走馬胎生物堿過程中擬合較好，能充分說明走馬胎生物堿測定過程，因而可以利用該模型進行后續的優化設計.由表3可以得出：一次項A、C具有極顯著性(p＜0.01);交互項AC和二次項C2具有顯著性(p＜0.05).綜合三種因素的F值，可以得出影響測定走馬胎生物堿因素的重要性大小順序為C＞A＞B，即緩沖液p H值＞靜置時間＞酸性染料用量.

2.3.2 顯色條件的優化

以響應值最大值為目的，運用Design-Expert 7.0軟件對模型參數進行優化，得出最佳測定走馬胎生物堿條件：靜置時間2 h;酸性用量6.93 ml;緩沖液p H=7.20.據此優化條件測定走馬胎生物堿，吸光度值可以達到0.449.酸性染料用量對模型不存在顯著影響，結合實踐可操作性，可以把酸性染料用量修正為7.00 ml.按照此修正條件，進行5次平行試驗.試驗結果如下：0.445、0.427、0.440、0.459、0.449，平均值為0.444，RSD為2.70%.該平行試驗所測得的平均值0.444與模型理論值0.449相差不大，沒有達到顯著性水平.說明該實驗方法重現性，精密度較好，所選的測定條件較為理想，可以作為酸性染料法測定走馬胎生物堿的顯色條件.

2.3.3 穩定性實驗結果

顯色測第一次吸光值后，每隔0.5 h測1次，共測6次.所測得的6次吸光值依次為：0.461、0.453、0.443、0.443、0.443、0.438，平均值為0.447，RSD為1.89%.這些數據充分證明供試樣品溶液顯色后的吸光度值在2.5 h之內基本穩定，可滿足基本的測定要求.

2.3.4 重復性實驗結果

按照響應面優化的條件進行顯色后，同批次的5份走馬胎樣品溶液的吸光度值為0.457、0.434、0.434、0.462、0.446、0.438，平均值為0.445，RSD為2.70%.說明酸性染料法在此優化顯色條件下重現性較好，所得的數據可靠.

2.3.5 標準曲線的繪制

由圖3可知，標準溶液中生物堿含量在0.0146～0.146 mg之間與吸光度存在較好線性關系，線性方程為y=4.8462x+0.016，相關系數R2=0.9994.

圖3 標準曲線Fig.3 Standard curve

2.3.6 樣品的測定和加標回收實驗

由表4，5份空白樣品溶液(不加入標準溶液)含生物堿的量為0.0650 mg、0.0639 mg、0.0620 mg、0.0592 mg、0.0638 mg，平均值為0.0628 mg，RSD值為3.66%，說明該法在優化的顯色條件下測定走馬胎生物堿含量可行，精密度較好.6份加標溶液的回收率為97.99%、91.27%、102.30%、93.75%、95.16%、99.89%，平均值為96.73%，RSD值為3.66%.這些數據充分體現了酸性染料法在響應面優化的條件下測定走馬胎生物堿含量是可行、可靠，準確度高.

表4 樣品和回收率試驗結果Tab.4 The result of recovery test and Ardisia gigantifolia Stapf's determination

3 結論與討論

該實驗基于單因素實驗結果，利用Box-Behnken Design(BBD)試驗設計方法優化顯色條件，得出最佳實驗測定條件如下：靜置時間為2 h;酸性用量7 ml;緩沖液p H=7.20.在此條件下測定同批次走馬胎生物堿含量準確度高，平均加標回收率為97.99%，相對標準偏差為4.23%.該法簡單易操作、迅速、低成本、準確度較高，適用于走馬胎總生物堿的測定，同時也適合一般生物堿的測定.

其他中藥材總生物堿的測定條件(靜置時間、緩沖液p H值)和本實驗所優選出的條件相異，[17-19]這可能是沒有考慮各因素之間的交互作用所致.由表3可知，靜置時間與緩沖液p H值存在顯著性交互作用.因此，本實驗利用響應面優選的測定條件是可行、可靠的，適用于一般總生物堿的測定.