沉積物中的得克隆在中華圓田螺體內的積累及氧化應激效應

(浙江工業大學 環境學院，浙江 杭州 310014)

1970年以前，滅蟻靈作為殺蟲劑和添加型阻燃劑而被廣泛使用，但后來由于其生物毒性而被禁用[1-3]。得克隆( Dechlorane plus，簡稱 DP) 作為滅蟻靈的替代品而被研發生產，并廣泛應用于各類電子產品、電線電纜、尼龍和計算機外殼等材料中 。DP有順式-DP(syn-DP)和反式-DP(anti-DP)兩個異構體組成。DP的主要生產商為美國OxyChem公司和我國江蘇安邦電化學公司。兩個公司的DP產量分別450～4 500 t[11]以及300～1 000 t[4-5]。研究表明：在大氣、水體、沉積物、灰塵和樹皮等多種環境介質中，以及在生物、人體內均檢測到DP[6-12]。由于DP極高的疏水性(logKow=9.3)，水體環境中的DP將會吸附在懸浮顆粒物上，并下沉到沉積物中。我國各大水系，如長江流域、松花江流域、珠江流域和錢塘江流域等沉積物中均檢測到DP的殘留。對底泥中DP的直接利用可能是它們進入生物體的主要途徑之一。所以，有關底泥中DP的生物可利用性及生態毒理性研究，對于預測該類化合物的生物富集、食物鏈傳遞及健康風險均至關重要。但到目前為止，相關研究仍然非常匱乏。

中華圓田螺(Cipangopaludinachinensis)，生活在水系底部，屬于雜食性淡水甲殼類軟體動物，在我國分布廣泛。由于田螺生活在水系底部、移動緩慢，且其食物主要來源于底泥中的腐殖質，田螺能夠基本反映這一水域的污染情況，因此常被選用于生物積累及毒性實驗。因此本研究以中華圓田螺為模式生物，通過生物-沉積物積累因子(Bio-sediment accumulation factors，BSAFs)、過氧化氫酶(CAT)和丙二醛(MDA)等研究底泥中DP的生物可利用性及氧化應激效應。

1 材料與方法

1.1 標準樣品與試劑

順式-DP(syn-DP，99.8%)和反式-DP(anti-DP，99.8%)標準品購自美國Accustandard公司；13C-PCB 141，13C-PCB 208，13C-PCB 202購自美國劍橋同位素實驗室；CAT測試盒、MDA測試盒和蛋白質定量測試盒購自南京建成生物工程研究所；色譜純正己烷、丙酮及二氯甲烷購自百靈威科技有限公司。

1.2 染毒底泥的制備

實驗所用底泥參考本實驗室之前研究[14]。

濕法染毒：用丙酮制備質量濃度為100 mg/L的DP貯備液。稱取10g石英砂均勻平鋪于500 mL燒杯中，然后用微量進樣針依次加入3 mL DP貯備液、10 mL丙酮使溶劑能浸沒石英砂，待丙酮揮發至0.5 mL左右時，加入20 g土壤，并用不銹鋼勺攪拌均勻，重復這一步驟至500 g土壤全部放入燒杯中。最后加適量去離子水，保證土壤含水率約為30%。將燒杯放于自動攪拌器上攪拌72 h，期間每日查看含水率，適時補充去離子水。待攪拌結束后，將土壤轉移至不銹鋼盆中，將剩余2 500 g土壤逐漸加入，充分攪拌。攪拌完成后置于室溫下，避光保存15 d，用于后續實驗。

1.3 中華圓田螺的養殖和暴露實驗

實驗所用中華園田螺購自浙江省杭州市三塘小區菜市場，大小基本一致。培養水溫為20～25 ℃，晝夜光照比為6 h∶18 h的循環水系統中。培養所用水均為去氯自來水。

中華圓田螺暴露實驗方法具體如下：田螺置于底部平鋪有1 500 g染毒沉積物的36 L玻璃水槽內，沉積物和上覆水的體積比為1∶3，采用氧氣泵曝氣供氧，以使培養過程中上覆水中溶解氧保持3.0 mg/L以上。在第2，4，8，16，32天分別取樣。待處理的田螺先放置在清水里24 h，使其吐盡腸道里的沉積物，隨后將其解剖，依據組織不同分為肌肉和肝臟兩個組，放入聚四氟乙烯封口袋中，貼好標簽，置于-20 ℃冰箱里待測。

1.4 樣品的處理和凈化

1) 沉積物的前處理。稱取2 g沉積物于玻璃纖維濾筒中，加入0.5 g銅粉，加入示蹤標13C-PCB 141和13C-PCB 208，用140 mL二氯甲烷索氏提取48 h；提取液旋轉蒸發，并加入適量正己烷替換二氯甲烷，并最終濃縮至1 mL；濃縮后的提取液經層析柱凈化，層析柱填料從下至上分別為2 g無水硫酸鈉、2.5 g氧化鋁、3 g中性硅膠、2 g無水硫酸鈉，淋洗液為80 mL二氯甲烷；將淋洗液旋轉蒸發至2 mL，正己烷溶劑替換2次再次旋轉蒸發濃縮至2 mL；濃縮液經氮吹定容至1 mL，加入內標13C-PCB 202，保存在-20 ℃冰箱內待GC-MS分析測定。

2) 中華圓田螺的前處理。稱取2 g冷凍干燥后的中華圓田螺樣品于研缽中，并加入2 g無水硫酸鈉，充分研磨至田螺樣品呈粉末狀；置于玻璃纖維濾筒中，加入0.5 g銅粉，示蹤標13C-PCB 141和13C-PCB 208，用140 mL二氯甲烷索氏提取48 h；提取液經濃硫酸酸洗3次去脂肪，將酸洗后的提取液經沉積物相同凈化方法處理，最后待GC-MS分析測定。

1.5 儀器分析

目標化合物的儀器分析采用Agilent-7890氣相色譜儀-5973N質譜儀。

色譜條件：進樣口溫度設置為280 ℃，進樣方式為不分流模式，載氣為高純氦氣，流量為1.0 mL/min，進樣量為1.0 μL；色譜柱選用DB-5MS毛細管柱(30 m×250 mm×0.25 μm)；升溫程序：初始溫度80 ℃保持3 min，然后以10 ℃/min升至300 ℃并保持20 min。

質譜條件：離子源為負離子化學電離源(ECNI)，能量為70 eV；離子源、傳輸線和四極桿溫度分別設置為150，280，150 ℃；甲烷為反應氣體，采用選擇離子(SIM)模式進行目標化合物的定性定量分析；syn-DP和anti-DP檢測離子為653.8/651.8/655.8，示蹤標13C12-PCB 141和13C12-PCB 208的檢測離子為372/370/374和475.8/473.8/477.8，內標13C12-PCB202的檢測離子為441.8/439.8/443.8。

1.6 質量控制和保證

采用8點標準曲線內標法定量目標物，DP每種物質標準曲線的相關系數R2>0.998，示蹤標13C-PCB 141，13C-PCB 208和內標13C-PCB 202的線性相關系數R2>0.999。將10倍信噪比對應的目標物濃度作為實驗方法檢出限，得到目標物syn-DP，anti-DP在沉積物中的檢出限(以干重計)分別為0.03，0.027 ng/g，兩個化合物在中華圓田螺體內的檢出限(以干重計)分別為0.02，0.016 ng/g。syn-DP和anti-DP在沉積物中的回收率為113.3%和120.3%，在生物樣品中的回收率為101.5%和105.2%。

2 結果與討論

2.1 DP的生物積累效應

經過32 d的暴露實驗，DP在中華圓田螺體內不同時間的積累濃度如圖1所示：高(1 000 ng/g)、低(100 ng/g)兩個暴露水平下anti-DP(積累濃度曲線，高暴露水平：C=0.370t-0.174，R2=0.971，p<0.05；低暴露水平：C=0.149t-0.101，R2=0.948，p<0.05)和syn-DP(積累濃度曲線，高暴露水平：C=0.077t+0.272，R2=0.921，p<0.05；低暴露水平：C=0.04t+0.424，R2=0.652，p>0.05)在中華圓田螺體內的積累濃度隨暴露時間的增加而增加，但32 d暴露后，anti-DP和syn-DP在中華圓田螺體內的濃度未達平衡。低濃度暴露水平下，syn-DP和anti-DP的生物-沉積物積累因子(BSAF=CB/Cs，CB為化學品在生物體內濃度，Cs為化學品在沉積物中濃度)分別為0.82和0.40，顯著高于高濃度暴露水平(0.19和0.06)。此結果與Jia等[9]研究結論相似：由于DP的濃度分配未達到平衡，相對較低DP濃度的生物積累中BSAFs較高。數值上與Wang和Shen的研究結果有所區別但整體上相似。Wang等[5]研究了中國東北地區大連一河流的沉積物和魚類，得到syn-DP和anti-DP的BSAFs值為0.88(0.33～2.8)，0.33(0.086～1.0)，Shen等[15]得到安達略湖水生物的syn-DP和anti-DP的平均BSAFs值為0.8和0.3。可能原因是中華圓田螺屬于低營養級生物，Tomy等[16]研究表明anti-DP容易在高營養級魚類積累而syn-DP則更傾向積累于低營養級魚類。

許多研究用fsyn=syn-DP/(syn-DP+anti-DP)來描述異構體的相對豐度。工業品中fsyn為0.20～0.35[17]，本實驗暴露底泥中fsyn是0.24，基本和工業品的相對豐度相似。生物樣品暴露4 d時fsyn分別為0.41(低濃度組)和0.38(高濃度組)，隨著暴露時間的增加，低暴露組fsyn為0.57(第8天)、0.35(第16天)和0.25(第32天)，高暴露組則為0.38，0.19及0.18。可以發現兩組的fsyn值均隨時間增加先變大后變小，且高濃度組的下降幅度大于低濃度組。結果說明anti-DP在中華圓田螺體內更容易積累或者syn-DP更容易代謝，即中華圓田螺會對DP異構體選擇性積累或者代謝。此結果與先前李亦瑋[18]和Tomy[16]的研究相似。

圖1 DP在田螺體內的生物積累情況Fig.1 Bioaccumulation of DP in the mudsnail

2.2 DP對中華圓田螺的毒性效應

生物的生化反應被用作環境污染物的早期預警指標，而酶活性可以作為環境污染物的生物標記物。CAT酶活力能夠反映生物體內氧化還原程度，揭示生物受脅迫程度。MDA的量可以反映機體的脂質過氧化程度，從而間接反應細胞受到氧化損傷的程度。本實驗測量了暴露1，3，7，10 d的CAT酶和MDA含量，研究DP對中華圓田螺的毒性效應。

田螺體內CAT酶變化情況如圖2所示，整個暴露期間，空白組的肝臟和肌肉CAT酶濃度基本沒有發生變化(P>0.05)，實驗組的肝臟CAT酶濃度(每克蛋白中的酶活力單位)在同一時段遠大于空白組(差值2.18～39.34 U/g)，實驗肌肉組除了暴露第3 天也呈現一樣結果但差值沒有這么大(差值0.41～3.01 U/g)，此結果表明DP會導致田螺體內活性氧增加破壞機體，從而分泌大量CAT酶來保持正常的新陳代謝，同時由于肝臟組織比肌肉組織對外源性化學物質有更加強烈的代謝功能，所以肝臟中CAT酶濃度高于肌肉。對比高低兩個暴露濃度中肝臟內CAT酶變化可以發現：低暴露組CAT酶濃度隨時間的增加而增大，高暴露組CAT酶隨時間的增加先增大后降低，除了最后一天，同時段高暴露組CAT酶濃度大于低暴露組，說明DP濃度越高對機體毒性就越大。

丙二醛濃度可以反映機體的脂質過氧化程度，從而間接反映細胞受到氧化損傷的程度。MDA具體變化如圖3所示，前三天實驗組與空白組的MDA濃度(每毫克蛋白中MDA的摩爾數)差異不明顯(P>0.05)，第7天開始實驗組MDA濃度明顯大于空白組，且兩者之差達到最大值，其中高暴露濃度下，肝臟和肌肉組中分別相差12.98，2.74 nmol/mg。對比暴露實驗中肝臟肌肉的MDA發現：與CAT酶濃度類似，肝臟中MDA濃度大于肌肉，高濃度組大于低濃度組。

圖2 CAT酶濃度隨時間的變化Fig.2 Variation of CAT level in different exposure time

圖3 MDA濃度隨時間的變化Fig.3 Variation of MDA level in different exposure time

綜上所述，CAT酶活性在暴露初期的升高，說明DP能夠啟動中華圓田螺的抗氧化系統，產生抗氧化防御，但是隨著暴露時間的延長，由于產生了脂質過氧化產物導致氧化損傷，CAT酶呈現出下降趨勢。與其他研究對比也發現相似的規律，Zhang等[6]指出：蚯蚓暴露在DP中，隨著暴露時間的延長和濃度的增加，超氧化物歧化酶持續增加，使得天然的抗氧化系統崩潰。脂質過氧化產物MDA在暴露期間，呈現出先增加后減少再增加的趨勢。Yang等[19]將蚯蚓作為受試生物，將其暴露在不同濃度DP下，發現經過28 d的暴露，DP并不能對蚯蚓產生直接毒性，但是對其產生的氧化損傷卻不容忽視，酶的活性顯著降低。在DP質量分數超過0.5 mg/kg后，CAT也受到了顯著抑制。

3 結 論

以中華圓田螺為模擬生物，研究了DP的生物積累性和生物的氧化應激效應。計算所得BSAFs值和不同暴露時間的fsyn，發現DP生物積累性不強，但DP異構體在生物體內發生選擇性積累或代謝。通過分析不同時段的CAT酶和MDA的濃度，發現DP會對生物體造成氧化損傷。