赤紅壤條件下宿根甘蔗根際可培養細菌的多樣性研究

農澤梅，史國英，曾 泉，葉雪蓮，秦華東，胡春錦*

(1.廣西大學農學院，廣西 南寧 530005；2.廣西農業科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007)

【研究意義】甘蔗(Saccharumofficinarum)是我國重要的糖料作物。宿根蔗栽培是甘蔗的種植生產上一項重要的栽培制度，我國甘蔗宿根年限一般只有1～2年，但國外可達4～7年[1-2]。影響甘蔗宿根年限的主要因素是土壤的質量和甘蔗品種的差異。廣西是我國主要甘蔗和蔗糖產區，但該地區的土壤類型(赤紅壤)存在耕層薄、肥力偏低、水土養分流失嚴重等不利因素，超過2年宿根年限甘蔗表現減產比較嚴重[3]。根際微生物對土壤肥力的形成、植物營養的轉化等具有重要作用[4-7]，開展赤紅壤條件下宿根甘蔗根際可培養細菌的多樣性研究，對充分發揮赤紅壤土壤肥力的維持和提高、激發蔗區的生產潛力、選種宿根性良好的甘蔗品種乃至保障我國蔗糖產業健康發展均重要意義。【前人研究進展】關于根際微生物的多樣性及其生態功能的研究一直廣受關注[4]。土壤微生物群落多樣性研究可為合理利用資源、解決農田生態系統失衡提供理論依據，同時，植物根際細菌的研究有利于進一步認識“植物根系―細菌”的共生體系協同進化的機制[8-9]。前人研究表明，作物長期連作會嚴重降低土壤微生物種類和活性，導致植物根際土壤營養元素活性降低和微生物群落對外界抵抗力降低，甘蔗宿根連作引起產量下降等作物連作障礙與其根際微生態系統失衡有著密切關系，保持土壤微生物活性是緩解和消除宿根甘蔗衰退的重要措施，也是維持蔗田土壤系統穩定性和可持續發展的重要保障[10-11]。據相關研究報道，不同栽培模式條件下，不同甘蔗品種之間的根際微生態環境是存在明顯差異的，如單一的宿根連作導致其根際土壤總微生物量及酶活性下降，引起土壤微生物介導的營養循環受阻，從而導致甘蔗產量下降[12-15]。高欣欣等研究發現[11]，宿根甘蔗土壤與新植甘蔗土壤相比，一些具有重要生物學和生態學功能的微生物種群如固氮菌等數量呈下降趨勢，但具有代謝甲醇與降解纖維素功能的細菌種群數量有所上升。我國甘蔗主產區的主要耕作土壤類型為紅壤土或赤紅壤土，具有低pH、低養分含量、硝化與反硝化活性低等特點，因此，高投入的種植模式一直是提高甘蔗產量必不可少的措施[16]。然而，過度依賴投入而忽略自然生態過程的種植模式已然不利于農業的可持續發展，必須重視土壤的改良[17-18]。當前，利用微生物菌劑來解決作物的連作障礙問題已成為農業生產發展中新的熱點。向土壤中施入微生物菌對于改善土壤生態環境、提高農作物產量和品質具有極其重要的作用，特別是對于具有低pH、低養分含量和易淋溶特性的紅壤或赤紅壤土壤類型，通過施用土壤改良劑并結合添加外源微生物菌劑進行土壤微生態環境改良是非常必要的[19-22]。在眾多的土壤修復技術中, 添加土壤修復劑以及有益農業微生物菌劑是一種既有效又環保的方法，因為微生物在土壤中物質和能量的輸入輸出中扮演著非常重要的角色[12-15]。然而，在選用合適的微生物菌劑方面，需要充分考慮到外源微生物與作物以及土壤之間的相互適應問題。一般來說，選用來源與菌劑施用的作物土壤環境具有較高相似性的微生物會表現出更好的適應性。因此，在甘蔗土壤的生態改良上，施用來源于甘蔗根際土壤的功能微生物菌劑會比較有優勢。【本研究切入點】關于赤紅壤條件下不同品種宿根甘蔗根際可培養細菌種群的差異，以及宿根蔗根際潛在可利用微生物菌種資源的挖掘和利用，目前還缺乏系統的研究報道。【擬解決的關鍵問題】擬通過純培養法和基于 16S rDNA 基因序列的系統發育分析對同時種植在赤紅壤條件下、連續留宿根2年的10個甘蔗品種工藝成熟前期的根際可培養細菌的多樣性進行研究，以期為明確我國主要蔗區宿根甘蔗根際細菌的多樣性、挖掘更多的優良甘蔗根際細菌資源提供科學支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于廣西農業科學院試驗地(N 22°50′38.08″，E 108°14′44.65″)開展試驗，試驗地土壤類型為赤紅壤土，土壤的基本養分情況見表1。

供試甘蔗品種為10個來源于不同國家或地區的品種材料：RB86-7515(簡稱B8，引自巴西)和桂引B9(簡稱B9)、桂糖21號(GT21)、桂糖35號(簡稱GT35)、桂糖40(GT40)、桂糖41號(GT41)、桂糖42號(GT42)、桂糖43號(GT43)、新臺糖22號(簡稱ROC22)和粵糖93159(簡稱YT93159)。

表1 供試土壤的基本養分情況分析

供試牛肉膏蛋白胨培養基NA以及細菌基礎液體培養基LB參照相應的參考文獻進行配制[23]。

1.2 試驗方法

甘蔗的種植管理：10個甘蔗品種同時種植在廣西農業科學院的試驗地，甘蔗按常規的種植管理，采用隨機排列，種植10個甘蔗品種，連續留宿根2年。取樣分離甘蔗根際細菌的時期為2年宿根甘蔗的工藝成熟前期，取根際土壤進行細菌分離培養。土壤樣品采用五點取樣法，宿根蔗大多已長成一整叢，因此，采樣時要先去除大約5 cm的表土，再將宿根蔗整兜挖起來，然后收集附著于根系上的土壤，五點土樣混合為一份，去除須根和腐葉等雜質并過篩，最后分別裝入無菌袋，貼上標簽，帶回實驗室進行根際細菌分離。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 根際細菌的分離、計數和純化 稱取根際土樣5 g，用45 mL無菌水稀釋混勻，28 ℃120 r/min搖床溫化培養3 h，然后取100 μl加入900 μl無菌水按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6進行梯度稀釋，分別取梯度10-4、10-5和10-6的稀釋液100 μl均勻涂布在NA培養基平板上，28 ℃培養2 d后進行菌落計數，挑取培養性狀不同的單菌落在NA培養基上連續純化2～3次，最后挑取純化以后的單菌落，轉至 NA 斜面培養1～2 d，一份放置于4 ℃短期保存備用；另一份將菌苔刮下與40 %甘油混合，置于-80 ℃冰箱長期保存。所有菌株均保存于廣西農業科學院微生物研究所植物微生態菌種保藏室。

1.3.2 根際細菌的16S rDNA序列分析 PCR擴增模板制備： 將供試菌株接種到LB液體培養基培養 20 h后離心收集菌體備用。用細菌基因組DNA提取試劑盒，按產品說明書從供試菌株的LB培養物中提取小量基因組 DNA，保存于-20 ℃備用。利用細菌16S 通用引物，正向：27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)，反向：1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，擴增所有供試菌株的16S rDNA 基因。PCR擴增按史國英等[24]的方法進行。擴增產物經電泳檢測和純化后，送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上進行同源性比對。從Gen Bank數據庫獲得最相近的典型菌株的16S rDNA序列，用Clustal X按照最大同源性的原則進行排序，并用Neighbor-join法構建系統進化樹[25]。

1.3.3 根際可培養細菌種群的多樣性分析 根據菌株16S rDNA序列分析結果對所分離獲得的根際細菌進行種屬分類，利用群落數學生態學的研究方法分析和比較甘蔗不同品種根際可培養細菌的多樣性。細菌多樣性分析參考任強等[26]的方法，采用Marglef豐富度指數，Shannon-Wiener多樣性指數表示，指數計算公式如下：

(1) Marglef豐富度指數dma：dma=(S-1)/lnN

式中,S為物種數目，N為所有物種的個體數之和。

(2) Shannon-Wiener多樣性指數H′：H′ =-∑PilnPi

式中,Pi=Ni/N，Ni為第i種的個體數。

群落中生物種類越多代表群落的復雜程度增高，即H′值愈大，多樣性越高，群落所含的信息量愈豐富。

1.4 統計分析

采用Excel 2007對數據進行整理及制圖，并以SPSS 18.1對數據進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種甘蔗宿根蔗根際細菌的多樣性比較

利用NA培養基對10個不同品種宿根蔗根際土壤樣品進行細菌分離和純化，共獲得167株根際細菌，結果見表2；菌株編號為N15101～N15300，其中甘蔗品種B8和YT93159的可培養根際細菌的數量最多，而B9的根際細菌數量最少。從表2可見，不同甘蔗品種根際細菌群落的豐富度指數(dma)、Shannon-Wiener 多樣性指數(H′)，存在顯著差異(P<0.05)，豐富度指數為1.8034～3.6719，Shannon-Wiener多樣性指數則為1.1730～2.3161，其中以甘蔗品種B8的菌株個體數、豐富度指數和多樣性指數均為最高；其次為品種GT43，它的根際細菌豐富度指數和多樣性指數分別為3.2461和2.1661；品種YT93159的根際細菌菌株個數雖然也比較多，但其多樣性指數僅為1.61；品種GT43的根際細菌多樣性指數最低，僅為1.1730。

2.2 甘蔗根際細菌多樣性分析

對所有獲得的可培養根際細菌均進行了16S rDNA擴增和測序，序列通過 BLAST 程序與Gen Bank數據庫中已報道的16S rDNA序列進行相似性比對分析。所有供試菌株與Gen Bank中已報道菌株均具有較高的相似性(≥97 %)，167株甘蔗根際細菌在種屬水平上，可以劃分為31個不同分類單元，即可歸類于31個不同菌屬(表3和圖1)。

2.3 甘蔗根際細菌的系統發育學分析

選取31個不同菌屬的代表菌株及其相似性最高菌株的16S rDNA序列構建系統發育樹(圖2)。16S rDNA序列分析結果表明，167株宿根蔗根際細菌主要分屬于厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)和變形菌門(Proteobacteria)4大類群(表3，圖 2)。類群Firmicutes主要包含Bacillussp.、Paenibacillussp.、Paenisporosarcinasp.和Lysinibacillussp.等菌屬，其中Bacillussp.是所有可培養根際細菌中的最優勢菌屬，占41.92 %；類群Bacteroidetes主要包含Chryseobacteriumsp.、Pedobactersp.、Flavobacteriumsp.、Chitinophagasp.、Olivibactersp.、Niabellasp.等菌屬，其中Chryseobacteriumsp.是所有分離菌株中的第二大優勢菌屬，占10.78 %；類群Actinobacteria只包含Microbacteriumsp.、Streptomycessp.、Micrococcus sp.等菌屬，均為非優勢菌；類群Proteobacteria包含的菌屬最多，共有Enterobactersp.、Acinetobactersp.、Pseudomonassp.、Ensifersp.、Achromobactersp.、Stenotrophomonassp.等18個菌屬，都屬于非優勢菌屬，僅在部分或者個別甘蔗品種的根際分離獲得，但Acinetobactersp.在甘蔗品種GT40的根際細菌中屬于優勢菌屬，占該品種可培養根際細菌種群的29.4 %。

表2 不同品種宿根蔗根際細菌的多樣性比較

注：同列數據后不同小寫字母表示處理間差異達顯著水平(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters in same column represented significant difference at 0.05 level.

表3 不同品種甘蔗根際細菌基于16S rDNA序列分析的分類鑒定結果

續表3 Continued table 3

序號Serial number菌屬種類Species of bacteria genera不同品種甘蔗根際細菌菌株數量Rhizosphere bacteria stains number of different varieties sugarcaneGT21B8GT35GT43GT41ROC22B9GT42GT40YT9315924Niabella sp.000100000025Kosakonia sp.000010000026Micrococcus sp.000001000027Caulobacter sp.000000100028Cronobacter sp.000000000129Sphingobium sp.000000000130Pseudoxanthomonas sp.000000100031Escherichia sp.0000000010 合計 Total16201516161714161720

圖1 來源于10個不同品種宿根蔗根際細菌的主要種屬類群餅狀圖Fig.1 The pie chart owning to the taxonomy of rhizosphere bacteria from 10 ratoon sugarcane cultivars

3 討 論

3.1 不同品種宿根甘蔗根際細菌多樣性的差異

根際是土壤中圍繞著植物根的一個狹窄的區域。由于根系分泌物的選擇作用，通常根際微生物的種類較少[27]。本研究從10個種植在赤紅壤條件下宿根甘蔗的根際土壤中分離獲得167株根際細菌，它們在基于16S rDNA序列分析結果上屬于31個不同的菌屬。該結果顯示2年宿根蔗根際細菌還是比較豐富的，但其主要優勢菌群比較單一，最大的優勢菌屬是芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，占所有可培養根際細菌的41.92 %，其次為金黃桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)，占10.78 %，其它29個菌屬的菌株數量占比均不高，僅在部分或者個別甘蔗品種的根際土壤中分離獲得。究其原因可能是由于宿根蔗根系土壤的營養與化學環境相對比較穩定，有利于根系環境中優勢微生物菌群的發展，但是，相對穩定的根系環境又容易使菌群趁于單一，并不利于維持根系微生物的多樣性。本研究在一定程度上反映了不同甘蔗品種間根系微生態區系的差異，如10個甘蔗品種的根際細菌群落豐富度指數在1.8034～3.6719，表現為B8>GT43>GT42>ROC22>GT40>YT93159>GT41>B9>GT21>GT35；Shannon多樣性指數為1.1730～2.3161，其中除了品種桂引B8和GT43的多樣性指數分別達到2.3161和2.1661以外，其它8個品種的H′均低于2.0，多樣性指數最低的是GT35，僅為1.1730。前人研究結果表明，微生物多樣性的降低以及結構失衡是導致植物根際土壤營養元素活性降低和微生物群落對外界抵抗力降低的重要原因，維持作物根際土壤微生物群落結構穩定性，保持微生物活性是緩解和消除宿根甘蔗衰退的重要措施，也是維持蔗田土壤系統穩定性和可持續發展的重要保障[1, 11, 28]。因此，從本研究結果來看，甘蔗品種B8和GT43相比較其它8個品種表現出良好的宿根性優勢。該結果為進一步研究“甘蔗―根際細菌”的互作及其協同進化關系提供了一定的理論依據。但是，由于影響甘蔗宿根年限的主要因子眾多，如土壤營養失調、根系分泌物積累、土壤微生物區系變化以及病蟲害發生等，而本研究只分析了根際可培養細菌這一項指標，未能全面反映甘蔗根系微生物的變化，因此，不同品種根際可培養細菌菌群的差異是否與甘蔗的宿根性相關？在土壤微生態環境改良的措施上，品種選擇是否可以作為一個重要的參考指標？相關問題仍有等進一步的研究。由于自然界中只有0.1 %～1 %的微生物能通過常規方法能被培養，僅占自然界中微生物種類的極小部分[29]。因此，在今后的進一步研究中，應采用多種培養基對樣品進行分離培養，并結合利用不依賴純培養的分子生物學的方法來研究根際未培養或不能培養的微生物，才能更全面地了解宿根甘蔗的根際微生物種群信息。

3.2 宿根甘蔗根際細菌中具有潛在利用價值的菌種資源

本研究從宿根甘蔗的根際土壤中分離獲得167株可培養根際細菌，在基于16S rDNA序列分析結果上屬于31個不同的菌屬，其中最大優勢種群為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，占41.92 %，表明宿根甘蔗根際細菌中可能存在許多具有應用潛力的菌種資源，是根際促生細菌的重要資源庫。Bacillussp.屬內的多種細菌在農業上已得到廣泛利用。如巨大芽孢桿菌(B.megaterium)是一種解磷促鉀細菌，能夠分解土壤中的吸附態有機磷、無機磷；阿氏芽孢桿菌(B.aryabhattai)具有較強的纖維素分解能力[30-32]。這 2種細菌作為優勢種群存在于土壤細菌中，有利于土壤中磷和纖維素的分解，提高土壤肥力，促進作物的生產。此外，芽孢桿菌屬中的枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、甲基營養芽孢桿菌(B.methylotrophicus)等細菌對植物病原真菌或病原細菌具有抑制作用，是具有較好開發應用前景的生防細菌[33-34]。本研究獲得的宿根甘蔗根際細菌的另一個主要優勢菌群黃金桿菌屬(Chryseobacteriumsp.)的許多種也是重要的有機物降解菌，具有降解土壤中殘留化學農藥等生物學功能；而其它主要菌群，如假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、土地桿菌屬(Pedobactersp.)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)和微桿菌(Microbacteriumsp.)等菌屬的許多種均具有固氮、生防和促進植物生長等重要生物學和生態學功能[35-36]。這些菌群在開發新型微生物肥料、研制高效微生物農藥或者作為微生物接種劑促進農作物生長以及通過微生物降解來治理環境、改善農業生態環境的上都具有良好的應用潛力。宿根甘蔗根際細菌的主要種群中包含許多具有潛在應用價值的微生物菌種資源。本研究結果可為進一步研究“甘蔗―根際細菌”的互作及其協同進化關系提供理論依據。

4 結 論

本研究反映了赤紅壤條件下宿根甘蔗根際具有豐富的可培養細菌多樣性，但是優勢菌群比較單一，不同甘蔗品種間存在顯著差異，其中甘蔗品種B8和GT43根際細菌群落的豐富度指數和多樣性指數均相比較高，具有維持宿根甘蔗根際土壤微生物群落結構穩定性的相對優勢。