黃酒對(duì)健康大鼠肥胖相關(guān)指標(biāo)的影響

王麗媛，秦 文，霍軍生，卓 勤，楊 倬，王晶波，沈 葹，李 巖*

（中國(guó)疾病預(yù)防控制中心 營(yíng)養(yǎng)與健康所，北京 100050）

黃酒作為中國(guó)傳統(tǒng)釀造酒的代表，最早可追溯到夏商時(shí)期，古人利用酒曲復(fù)式發(fā)酵法制作黃酒[1]。因此，黃酒與葡萄酒、啤酒并稱“世界三大古酒”，享有“國(guó)酒”的美譽(yù)[2]。黃酒在諸多史料和文學(xué)作品中都有記載，如書圣王羲之于曲水流觴之際醉書“天下第一行書”的《蘭亭集序》；南宋詩(shī)人陸游吟誦當(dāng)時(shí)的紹興釀酒業(yè)的“城中酒壚千百家”；近代魯迅筆下的咸亨酒店，呈現(xiàn)了諸多中國(guó)黃酒的傳統(tǒng)典故和傳統(tǒng)文化[3]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，黃酒中含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸、活性肽、酚類、低聚糖、維生素、礦物質(zhì)等基本營(yíng)養(yǎng)成分以及γ-氨基丁酸、多酚類物質(zhì)、生物活性肽、功能性低聚糖、Monacolin K等具有特殊生物活性的功能性物質(zhì)，具有抗衰老、降血壓、降膽固醇和免疫調(diào)節(jié)的生理功效[4]。

肥胖已成為當(dāng)今全球性健康問(wèn)題之一，易引發(fā)高血壓、冠心病、血脂異常等多種慢性疾病，成為危害大眾健康水平和生活狀態(tài)的重要原因。盡管黃酒有諸多保健功能，但黃酒同啤酒一樣，常被稱為“液體面包”[5]，飲用黃酒能否引起肥胖成為人們關(guān)注的問(wèn)題。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了黃酒與健康大鼠肥胖相關(guān)指標(biāo)體質(zhì)量、血脂及腸道菌群的初步研究，揭示黃酒與機(jī)體肥胖的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)特定病原體（species pathogen free，SPF）級(jí)SD雄性大鼠（共24只，體質(zhì)量（200±20）g）：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2014-0006]。

黃酒（紹興黃酒，三年陳釀，酒精度15%vol）：市售；食用酒精（普通級(jí)，酒精度95%vol）：市售。

腸道細(xì)菌脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：深圳華大基因科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RV10V-C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國(guó)IKA公司；ME403E天平：瑞士梅特勒公司；AC2-4S1生物安全柜：新加坡ESCO公司；5427R高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)EPPENDORF公司；全自動(dòng)生化分析儀7600系列：日本HITACHI公司；Illumina HiSe2500測(cè)序儀：美國(guó)Illumina公司；NANO DROP紫外分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)疾病預(yù)防控制中心南緯路動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，許可證號(hào)SYXK（京）2009-0032，室溫20～26℃，相對(duì)濕度40%～70%，12 h光照，12 h黑暗。動(dòng)物適應(yīng)3 d后根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為黃酒組、酒基對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組動(dòng)物各8只。黃酒組動(dòng)物灌胃黃酒，酒基對(duì)照組動(dòng)物灌胃15%酒基（95%食用酒精調(diào)配），空白對(duì)照組灌胃蒸餾水，灌胃量均為10 mL/kg體質(zhì)量，連續(xù)灌胃35 d。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，三組動(dòng)物均給予基礎(chǔ)飼料，每周稱質(zhì)量一次，并調(diào)整灌胃量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，大鼠禁食24 h，眼眶采血，離心收集血清待測(cè)；解剖取肝臟稱質(zhì)量；取各組動(dòng)物糞便-80℃冷凍保存待測(cè)。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已通過(guò)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與健康所倫理審查。

1.3.2 血液生化測(cè)定

采集的大鼠血液3000r/min離心15min，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high desity lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low desitylipoproteincholesterol，LDL-C）指標(biāo)。

1.3.3 腸道菌群高通量測(cè)序分析

采用華大基因研發(fā)的腸道細(xì)菌DNA提取試劑盒對(duì)各大鼠糞便樣品進(jìn)行DNA提取，并使用通用引物515F（5"-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3"）和806R（5"-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3"）對(duì)16S rDNA的V4區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。

應(yīng)用IlluminaHiSe2500平臺(tái)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序類型為PE250。下機(jī)數(shù)據(jù)濾除低質(zhì)量的reads，獲得cleandata。使用軟件FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），將雙末端測(cè)序得到的reads拼接成Tags，利用軟件USEARCH（v7.0.1090）將優(yōu)化好的Tags在97%的相似度下聚類為分類操作單元（operational taxonomic units，OTU），用于物種注釋、物種復(fù)雜度分析以及組間物種α-多樣性分析。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 16.0處理，各組以變異數(shù)進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)方差（xˉ±s）表示，P≥0.05無(wú)顯著差異，0.01≤P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

由表1可知，灌胃35 d后的黃酒組大鼠與空白對(duì)照組相比，體質(zhì)量增量未見(jiàn)顯著差異（P≥0.05）。有文獻(xiàn)表明[6]，50.0 mL/kg體質(zhì)量劑量的黃酒在維持動(dòng)物體質(zhì)量方面具有一定作用。本研究中動(dòng)物直接灌胃黃酒，濃度較低，并未見(jiàn)明顯作用，但黃酒組大鼠體質(zhì)量增量較空白對(duì)照組有下降的趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，各組大鼠均保持正常飲水進(jìn)食，精神狀態(tài)良好。

表1 各組大鼠體質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of body mass of different groups of rats g

2.2 黃酒對(duì)大鼠血脂的影響

由表2可知，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，黃酒組大鼠血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的含量與空白對(duì)照組相比差異均不顯著（P≥0.05），TG含量較空白對(duì)照組有升高的趨勢(shì)，但該值在0.77～2.10 mmol/L正常監(jiān)測(cè)范圍內(nèi)，酒基對(duì)照組動(dòng)物結(jié)果同黃酒組。說(shuō)明限量飲酒不會(huì)對(duì)血脂產(chǎn)生不良影響，但長(zhǎng)期飲酒可能會(huì)引起TG水平上升。

表2 各組大鼠血脂指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果Table 2 Determination results of blood lipid indexes of different groups of rats mmol/L

2.3 黃酒對(duì)大鼠腸道菌群的影響

2.3.1 黃酒對(duì)大鼠腸道微生物菌群α-多樣性的影響

腸道微生物多樣性是促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收、維持機(jī)體免疫和新陳代謝的基礎(chǔ)，多樣性降低極易對(duì)宿主免疫產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響健康[7]。各組樣品所有序列按照97%的相似度進(jìn)行OTU聚類，利用程序運(yùn)算得到評(píng)價(jià)微生物Alpha多樣性（Alpha diversity）豐度。Alpha多樣性是對(duì)單個(gè)樣品中物種多樣性的分析[8]，包括Observed-species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)，前面4個(gè)指數(shù)越大，最后一個(gè)指數(shù)越小，說(shuō)明樣品中的物種越豐富。物種豐富度相同的情況下，群落中各物種均勻度越大，群落多樣性越大[9]。表3結(jié)果表明，黃酒組Observed-species指數(shù)、Chao指數(shù)、Ace指數(shù)與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)沒(méi)有顯著差異（P≥0.05）。由此推斷，黃酒對(duì)大鼠腸道菌群α-多樣性沒(méi)有顯著影響（P≥0.05）。

表3 大鼠腸道菌群α-多樣性統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Alpha diversity statistical analysis of gut microbiota in rats

2.3.2 黃酒對(duì)大鼠腸道菌群門水平豐度的影響

各組樣品共產(chǎn)生938個(gè)OTU，被注釋到7個(gè)細(xì)菌門類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、柔膜菌門（Tenericutes）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和迷蹤菌門（Elusimicrobia），各組菌群組成和比例如圖1所示。

圖1 各組大鼠腸道菌群在門水平上的注釋結(jié)果Fig.1 Annotation results of gut microbiota in different groups of rats based on phylum-level

在腸道菌群中影響能量代謝平衡的兩個(gè)主要群落是擬桿菌門和厚壁菌門，已經(jīng)有研究表明，該兩種菌的含量和比例可作為判定肥胖潛在可能的依據(jù)[10-12]。XIE W等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)，瘦的動(dòng)物或者人與肥胖的對(duì)照組相比，具有更多的擬桿菌門和較少的厚壁菌門。由圖1可知，與空白對(duì)照組相比，黃酒組擬桿菌門上升了15%，厚壁菌門下降了16%，而酒基對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，擬桿菌門下降了27%，厚壁菌門上升36%。結(jié)合2.1中的結(jié)果分析推測(cè)，健康大鼠體質(zhì)量增加緩慢的趨勢(shì)可能與黃酒改變了厚壁菌門和擬桿菌門含量有關(guān)。

2.3.3 黃酒對(duì)大鼠腸道菌群屬水平豐度的影響

在屬的水平上各組樣品主要注釋到21種菌，分別是不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、嗜粘蛋白-艾克曼菌屬（Akkermansia）、Anoxybacillus屬，擬桿菌屬（Bacteroides）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）、梭菌屬（Clostridium）、糞球菌屬（Coprococcus）、Corynebacterium屬、Geobacillus屬、乳桿菌屬（Lactobacillus）、甲烷短桿菌屬（Methanobrevibacter）、顫螺旋菌屬（Oscillospira）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、普雷沃氏菌（Prevotella）、氏菌（Roseburia）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、八聯(lián)球菌屬（Sarcina）、Sutterella屬、Turicibacter屬、02d06菌屬及rc4_4菌屬。各組菌群組成及比例如圖2所示。

圖2 各組大鼠腸道菌群在屬水平上的注釋結(jié)果Fig.2 Annotation results of gut microbiota in different groups of rats based on genus-level

由圖2可知，黃酒組、酒基對(duì)照組和空白對(duì)照組中，普雷沃氏菌（Prevotella）豐度相對(duì)較高，其次是乳桿菌屬（Lactobacillus）和瘤胃球菌（Ruminococcus）。與空白對(duì)照組相比，黃酒組中雙歧桿菌屬、嗜粘蛋白-艾克曼菌屬和擬桿菌屬含量分別上升122%、76%、123%。黃酒組與酒基對(duì)照組相比，上述3個(gè)菌屬含量分別上升79%、126%、38%。黃酒中含有的功能性低聚糖可以被腸道內(nèi)的雙歧桿菌利用，促進(jìn)雙歧桿菌增殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[15]。雙歧桿菌是構(gòu)成腸道定殖抗力的主要細(xì)菌之一，其代謝產(chǎn)物主要是有機(jī)酸，引起腸道pH值下降，抑制了腸道致病菌如金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、痢疾桿菌、艱難梭菌及沙門氏菌等的生長(zhǎng)繁殖，而自身的生長(zhǎng)不受抑制，維持了腸道菌群的相對(duì)平衡[16-17]。DAO M C等[18-20]研究表明，嗜粘蛋白-艾克曼菌（Akkermansia muciniphila）是腸道中的一種黏蛋白降解菌，在肥胖及相關(guān)代謝疾病（如糖尿病）中具有關(guān)鍵作用，可以調(diào)節(jié)人體能量平衡及脂代謝水平，其組成比例與宿主的健康之間存在正相關(guān)。有研究表明，擬桿菌在幫助宿主分解多糖、加快腸粘膜血管形成以及提高宿主免疫力、維持腸道微生態(tài)平衡等方面起到了重要作用[21-22]。結(jié)合2.1中的結(jié)果推測(cè)，黃酒組動(dòng)物體質(zhì)量增量緩慢的趨勢(shì)可能與艾克曼菌屬和擬桿菌屬組成比例呈正相關(guān)。

3 結(jié)論

黃酒對(duì)健康大鼠體質(zhì)量沒(méi)有明顯降低的作用（P≥0.05），但對(duì)大鼠體質(zhì)量增加有減緩的趨勢(shì)。在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，黃酒對(duì)健康大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量沒(méi)有顯著影響（P≥0.05）。在門水平上，黃酒能夠上調(diào)厚壁菌門并下調(diào)擬桿菌門的組成比例；在屬的水平上，黃酒能夠上調(diào)雙歧桿菌屬、嗜粘蛋白-艾克曼菌屬和擬桿菌屬的組成比例，推測(cè)黃酒能夠改變與體質(zhì)量有關(guān)的大鼠腸道菌群組成比例，并對(duì)改善宿主腸道菌群結(jié)構(gòu)有促進(jìn)作用。