高產酯化酶紅曲菌的篩選、鑒定及酶學性質研究

劉歡歡，楊 帆，李貞景，王旭鋒，薛意斌，陳勉華，王昌祿*

（1.天津科技大學 省部共建食品營養與安全國家重點實驗室，天津 300457；2.天津科技大學 食品工程與生物技術學院，天津 300457）

紅曲菌屬（Monascus spp.）是我國重要的藥食兩用微生物，能夠產生多種酶系，包括酯化酶、糖化酶及酸性蛋白酶等，在發酵食品中具有非常重要的意義[1-2]。其中，酯化酶可催化多種有機酸與乙醇生成己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯等酯類物質，使濃香型白酒的香氣更加豐滿協調[3-4]。

至今為止，關于紅曲霉產酯化酶的研究主要包括：高產酯化酶紅曲菌株的分離、純化、鑒定及產酶條件優化[1，5-7]；多酶系紅曲菌株的研究[8]；紅曲霉發酵黃水研究[9]；紅曲霉酯化黃水制備酯化液[10]；復合酯化酶制劑的研究[11]等。有研究表明，酵母、紅曲霉共發酵與堆積發酵配套工藝相結合，能使白酒中總酯含量增加，尤其是己酸乙酯，提高白酒酯化液品質[9，12]。目前，在工業上，一般采用固態發酵紅曲霉產酯化酶[5-7]。然而，固態發酵受傳質傳熱以及發酵調控的限制[13]，導致紅曲發酵周期長，酶制備效率低。因此，通過液態發酵生產高活性酯化酶，具有較大的潛力。

本研究從實驗室保藏的10株紅曲菌株中篩選1株高產酯化酶的菌株，通過分子生物學技術對其進行鑒定，并對其最適培養基進行篩選，最后對該紅曲霉所產的酯化酶酶學特性進行初步研究，為利用紅曲菌對白酒增香提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

紅曲菌株M1、M3、M7、M8、M9、M11、X1、X2、CG-6、C003：天津科技大學食品工程與生物技術學院發酵食品與微生物資源開發研究室保藏。

1.1.2 試劑

脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京康為世紀生物技術公司；蛋白胨（生化試劑）、2×Primer STAR Buffer、Taq聚合酶（5 U/μL）：北京索萊寶生物有限公司；硝酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖等（均為分析純）：天津市光復精細化工研究所。

1.1.3 培養基

麥芽汁培養基：參照文獻[14]進行制備。

種子液培養基：大米粉30 g/L，NaNO33 g/L，KH2PO42.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH自然。

初篩培養基：無水葡萄糖60 g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO310 g/L，KH2PO410 g/L，MgSO4·7H2O 5 g/L，pH自然。

復篩培養基1：可溶性淀粉70 g/L，大豆蛋白胨20 g/L，NaNO32g/L，KH2PO41g/L，MgSO4·7H2O2g/L，pH 4.5；復篩培養基2：葡萄糖50g/L，蛋白胨20 g/L，NaNO32g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH 5.0；復篩培養基3：大米粉50 g/L，NaNO33 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，pH自然；復篩培養基4：在復篩培養基3的基礎上加入20 g/L大豆蛋白胨。

以上培養基的滅菌條件均為121℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1FD型超凈工作臺：上海博訊事業有限公司醫療設備廠；LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海華線醫用核子儀器有限公司；KCL2000型恒溫恒濕培養箱：日本EYELA東京理化公司；AG22331型高速離心機：德國Ep pendorf公司；070-851型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀：德國Biometra公司；ZWY-2112D型恒溫培養振蕩器：上海支撐分析儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高產酯化酶紅曲菌株的篩選

將紅曲菌株M1、M3、M7、M8、M9、M11、X1、X2、CG-6、C003的孢子懸浮液（5.0×105個/mL）以10%（V/V）的接種量接種到初篩培養基中，30℃、180 r/min條件下振蕩培養4 d，以發酵上清液中的酯化酶活力為指標進行初篩。

以10%的接種量將初篩菌株的孢子懸浮液分別接種于復篩培養基1、2、3，30 ℃、180 r/min條件下培養5 d，定期檢測上清液中酯化酶酶活變化，以達到最高酯化酶活力時間、酶活力為指標進行復篩。

1.3.2 紅曲霉液態發酵產酯化酶培養基的選擇

將菌株X1、X2接種于4種復篩培養基中，培養到最高酶活為止，以酯化酶活力為指標，選擇紅曲霉液態發酵產酯化酶的最佳培養基。

1.3.3 酯化酶活性的測定

采用1-萘酚比色法對酯化酶酶活進行測定[15]。將0.5mL上清液和3 mL pH=6.0的磷酸緩沖液混合后，添加0.1 mL 1-醋酸萘酯，空白組不添加1-醋酸萘酯，37℃水浴反應15min后加0.4 mL固藍B鹽，37℃保溫10 min，在波長528 nm處測定吸光度值。

酯化酶酶活定義：在pH=6.0、37℃條件下，15 min水解1-醋酸萘酯產生1.0 nmol的1-萘酚所需酶量為1個酶活單位（U/mL）。

1.3.4 紅曲霉菌種的分子生物學鑒定

將菌株X1的孢子懸浮液接種于復篩培養基2中，30℃、180 r/min條件下培養3d，8000r/min離心10min，取菌體，無菌水反復沖洗3次后，于-80℃保存備用。

采用DNA試劑盒法提取菌株X1的DNA，以其為模板，采用通用引物ITS-1（5"-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3"）和ITS-4引物（5"-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3"）進行PCR擴增[16]。

PCR擴増體系：DNA模板2 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTPs）（2.5 mmol/L）4 μL，2×Primer STAR Buffer 25 μL，引物各1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補充至50 μL。PCR擴增程序：96℃預變性1 min；96℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸90 s，共35個循環；72℃再延伸10 min。PCR擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，凝膠成像儀中觀察條帶，PCR擴增產物送至蘇州金唯智生物科技有限公司進行測序。

PCR擴增產物序列提交至美國國立生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數據庫中進行BLAST搜索，選取同源性較高的菌株，采用軟件clustal×1.83進行多序列比對，用MEGA 5.10軟件中的鄰接（neighbor-joining，NJ）法構建系統發育樹[17]。

1.3.5 酯化酶酶學特性研究

最適反應溫度及pH值：設定反應溫度分別為25℃、35℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、55 ℃；pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0。測定酯化酶活力，研究酯化酶的最適反應溫度及pH值。

溫度及pH穩定性：將粗酶液在25℃、35℃、45℃、55℃、65 ℃條件下分別水浴0、10 min、20 min、30 min、40 min后，冷卻；將pH 5.0、6.0、7.0、8.0的3 mL磷酸鹽緩沖溶液分別與0.5 mL酶液混合均勻，在4℃條件下保存24 h。測定殘余酶活力，最大酶活力記為100%，計算相對酶活力，研究該酯化酶的溫度及pH穩定性。

2 結果與分析

2.1 高產酯化酶紅曲菌株的篩選

采用初篩培養基對10株紅曲霉進行初篩，酯化酶活力測定結果見圖1。

圖1 不同紅曲霉的酯化酶活力Fig.1 Esterase activity of different Monascus

由圖1可知，不同紅曲霉液態發酵產酯化酶的能力不同，其中菌株X2的酯化酶活力最高，為346.28 U/mL，菌株X1次之（338.37 U/mL），菌株M1、M3、M7、M8、C003等產酯化酶能力較低。菌株X1和X2的酯化酶活力差異較小，因此，采用3種復篩培養基（1、2、3）對菌株X1和X2進行進一步篩選，結果見圖2。

圖2 菌株X1（a）和X2（b）在不同培養基中的酶活Fig.2 Enzyme activity of strain X1(a)and X2(b)in different media

由圖2可知，無論何種培養基，兩株菌的發酵上清液中酯化酶酶活均呈現先上升后下降的趨勢，菌株X1和X2在不同培養基中培養時，最高酶活出現時間均相同，可見兩株菌的生長和酯化酶生產狀況非常相近。從最高酶活出現的時間上看，復篩培養基2最早，這可能與培養基中碳源有關[18]。此外，復篩培養基3中沒有加入遲效氮源，影響了酯化酶的產生[19]。為此，在復篩培養基3中加入20 g/L的大豆蛋白胨，成為復篩培養基4，進行后續實驗。

2.2 紅曲霉液態發酵產酯化酶培養基的選擇

采用4種復篩培養基對菌株X1和X2進行發酵，重復3次，從中選擇穩定性最佳的發酵培養基，結果如圖3所示。

圖3 菌株X1和X2在不同復篩培養基中的酯化酶活性Fig.3 Esterase activity of strain X1 and X2 in different secondary screening media

由圖3可知，菌株X1和X2在復篩培養基1的酯化酶活力高于其他3種培養基，且穩定性良好，由此可知，復篩培養基1更適合紅曲霉菌株的生長及產酶；菌株X1的酯化酶活力均高于菌株X2，且在復篩培養基1條件下，酯化酶酶活最高，為315.19 U/mL，菌株X2為X1酶活的92.07%。因此，菌株X1在液態條件下發酵分泌酯化酶能力更強。同時，培養基4中，大豆蛋白胨的加入有效提高了發酵液的酶活力，但仍顯著低于復篩培養基1和2。因此，選擇菌株X1進行分子生物學鑒定。

2.3 分子生物學鑒定

菌株X1的系統發育樹見圖4。

圖4 基于ITS序列菌株X1的系統發育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain X1 based on ITS sequences

由圖4可知，菌株X1與血紅紅曲霉（Monascussanguineus）聚于一支，相似度最高。因此，鑒定菌株X1為血紅紅曲霉（Monascus sanguineous）。

2.4 酯化酶酶學特性分析結果

2.4.1 酯化酶的最適反應溫度及pH值

酯化酶的最適反應溫度及pH值測定結果如圖5所示。

圖5 酯化酶的最適溫度及pHFig.5 Optimal temperature and pH of esterase

由圖5可知，隨著反應溫度的升高，酯化酶活力呈先升高后下降的趨勢。當反應溫度為40℃時，酯化酶活力最高，為557.9 U/mL。分析原因可能是，酶作為反應催化劑，溫度可影響其本身某些基團的解離、與底物的結合等[20]。在一定溫度范圍內，隨著溫度升高，分子運動速率加快，酶促反應速率加快，而溫度過高，蛋白開始變性，酶活降低。因此，該酶的最適反應溫度為40℃。

由圖5可知，隨著反應體系pH值的增大，酯化酶活力呈先升高后下降的趨勢。當反應pH值為5.0時，酯化酶活力最高，為497.8U/mL。分析原因可能是，酶分子上有酸性和堿性的氨基酸側鏈基團，可直接影響底物的結合和進一步催化反應，也可能影響酶的空間結構，從而影響酶的活性[21]；此外，酶活性部位的解離以及底物結構的破壞都會導致酶-底物復合物不能進一步轉化成產物。因此，該酶的最適反應pH值為5.0。

2.4.2 酯化酶的溫度及pH穩定性

酯化酶的溫度及pH穩定性結果見圖6。

圖6 酯化酶的溫度和pH穩定性Fig.6 Temperature and pH stability of esterase

由圖6可知，當酯化酶在25℃和35℃條件下處理40 min后，相對酶活為78.08%、71.50%，酯化酶穩定性較好；45℃條件下處理40 min后，相對酶活為50.01%，酶穩定性較差；當處理溫度為55℃和65℃時處理10 min后，相對酶活為26.05%和14.75%，40 min后酶活幾乎下降為0，酶活不穩定。因此，該酯化酶在25～35℃條件下穩定性較好。

當pH值在5.0～6.0時，處理24 h后，酯化酶相對酶活＞80%，酯化酶較穩定，尤其是在pH 6.0緩沖液中保存時，相對酶活為90.65%；當pH值＞6.0時，酯化酶酶不穩定；pH為8.0時，相對酶活迅速降低為32.5%，表明該酶在堿性條件下易失活。

2.4.3 金屬離子對酯化酶活力的影響

不同金屬離子對酯化酶酶活的影響結果如圖7所示。

圖7 不同金屬離子對酯化酶活性的影響Fig.7 Effect of different metal ions on esterase activity

由圖7可知，Ca2+可以明顯促進該紅曲酯化酶的活性，相對酶活為110.28%，因此，可作為該酶的促進劑；K+對酯化酶活力的影響不顯著；而Mg2+、Na+、Fe2+和Ag+對該酯化酶均具有不同程度的抑制作用，其中Ag+對該酯化酶的抑制作用最明顯，相對酶活僅為10.22%，是該酶的酶活抑制劑。

3 結論

本研究通過篩選得到一株高產酯化酶的紅曲霉菌株X1，經分子生物學鑒定為血紅紅曲霉（Monascus sanguineous），其最適產酶培養基為可溶性淀粉70g/L，大豆蛋白胨20g/L，NaNO32 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，初始pH值4.5；采用最優培養基，在30℃、180 r/min條件下發酵4 d后，酯化酶酶活力為315.19 U/mL。粗酶酶學性質研究結果表明，該酯化酶的最適反應溫度為40℃，在25～35℃穩定性較好；最適pH值為5.0，在pH為5.0～6.0時，穩定性較高；Ca2+可提高該酯化酶活性，Mg2+、Fe2+、Na+、Ag+則有不同程度抑制作用，且Ag+抑制作用最明顯，相對酶活僅為10.22%。本研究為紅曲霉液態條件下分泌酯化酶進而制備酯化液提供參考，也為紅曲酯化酶制劑在白酒生產中的應用提供了更多依據。