響應面法優化木醋桿菌NUST4.2種子擴大培養條件

孫汴京，林建斌，自 強，陳春濤，孫東平*

（南京理工大學 化工學院，江蘇 南京 210094）

細菌纖維素是由某些微生物合成的一種多糖類高分子[1]，其三維網狀結構與植物纖維素的三維網狀結構基本相同，都屬于天然纖維素。但細菌纖維素的純度比植物纖維素的純度大，且合成效率也比植物纖維素的合成效率高，故細菌纖維素有植物纖維素無法比擬的特性[2-3]。在國內，對細菌纖維素的研究時間較短，研究人員已經認識到其蘊藏的發展前景和巨大的商機[4-5]。

工業化生產纖維素的菌株必須滿足纖維素產量高、生產成本低、菌體生長速度快、菌體傳代培養后遺傳性狀穩定等條件[6]。目前，能夠應用于工業化生產的菌株只有醋酸菌屬（Acetobacter）中的某些菌株[7]。醋酸菌屬中的木醋桿菌（Acetobacter xylinum）是細菌纖維素工業化生產中使用的典型菌種，也是細菌纖維素合成機理、形貌特征及結構研究的典型菌株[8-9]。當培養菌株的環境條件變化時，需要對優良菌株的培養基和培養條件進行優化，使菌種在短時間內的群體遺傳過程占優勢并具有較高的細菌纖維素生產能力[10-11]。根據菌種的生理特性，選擇合適的培養條件培養得到代謝旺盛的種子液，不僅可有效縮短發酵生產周期，而且可提高設備利用率[12]。

目前，基于Plackeet-Burman設計法的響應面分析法被越來越多的應用在細菌纖維素發酵培養基的優化上[13-14]，但是應用于細菌纖維素種子液擴大培養條件優化研究還鮮有報道。因此，本試驗以木醋桿菌NUST4.2為研究對象，OD600nm值為響應值，采用Plackett-Burman設計法、最陡爬坡路徑法和響應面分析法相結合對木醋桿菌NUST4.2種子擴大培養條件進行優化[15-17]，為工業化生產細菌纖維素提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

木醋桿菌（Acetobacter xylinum）NUST4.2：由本實驗室從殘次水果中篩選出產纖維素的野生菌，對其進行紫外誘變改良獲得，并4℃保藏于本實驗室。

1.1.2 試劑

纖維素酶（10 000 U/g）：阿拉丁化學試劑有限公司；葡萄糖、檸檬酸、硫酸鎂：國藥集團化學試劑有限公司；蔗糖：上海西王糖淀粉有限公司；磷酸二氫鉀：上海凌峰化學試劑有限公司；蛋白胨：上海博維生物科技有限公司；酵母浸粉、瓊脂粉：北京奧博星生物技術有限責任公司。以上試劑均為生化試劑或分析純。

1.1.3 培養基

斜面培養基：葡萄糖20 g/L，蔗糖10 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，檸檬酸1.1 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉1.0 g/L，瓊脂粉18 g/L，pH值6.0，用去離子水配制。121℃滅菌30 min。

種子培養基：葡萄糖20 g/L，硫酸鎂0.4 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，檸檬酸1.1 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉1.0 g/L，自然pH，用去離子水配制。121℃滅菌30 min。

1.2 儀器與設備

YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；QHZ-98A全溫度振蕩培養箱：太倉市華美生化儀器廠；FZ-D20L機械攪拌種子罐：江蘇豐澤生物工程設備制造有限公司；UV-1100可見-紫外分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 木醋桿菌NUST4.2種子擴大培養

挑取一環活化的斜面菌種至種子培養基中，30℃、150 r/min條件下振蕩培養24 h，然后以10%（V/V）的接種量將種子液轉移至20 L機械攪拌種子罐中擴大培養，30℃動態培養36 h，取樣測定菌體密度（OD600nm值）。

1.3.2 木醋桿菌NUST4.2種子擴大培養條件優化

Plackett-Burman（PB）試驗：Plackett-Burman試驗是一種近飽和兩水平試驗設計方法，能以最少的試驗次數對多種因素中的主效應進行估計，可以快速有效地從眾多待考察的因素中篩選出關鍵的影響因素，為進一步研究提供依據[14]。因此，以菌體OD600nm值（Y）為響應值，選取對木醋桿菌NUST4.2種子擴大培養影響的裝液量（A）、初始pH值（B）、攪拌轉速（D）、消泡劑用量（E）、罐壓（G）和通氣量（H）6個因素，采用N=12的試驗設計進行篩選優化，每個因素取2水平，分別設為-1和1，C和F為空白項。PB試驗因素與水平見表1。

最陡爬坡法試驗：采取最陡爬坡試驗法尋找響應值最大時的因素組合，以最大值組合作為中心組合設計的中心點進行響應面優化試驗。

中心組合設計（central compositedesign，CCD）：CCD是國際上常用的一種響應面法，能夠用有限的試驗次數對影響生物生長代謝過程的主要因素及其交互作用進行有效評價，并且能夠優化各因子[18]。在PB試驗和最陡爬坡試驗的基礎上，依據中心組合設計原理設計響應面分析試驗，對擬合數學模型和方差進行分析，通過各因素及其交互作用對微生物生長的影響進行評價，得到響應值最大時的最優條件。

表1 Plackett-Burman試驗設計的因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experimental design

驗證試驗：利用優化后的培養條件進行發酵驗證試驗，重復3次，取平均值。

1.3.3 測定方法

菌體密度的測定：比濁法測定[18-19]。取纖維素酶2 g置于100 mL 0.1 mol/L醋酸鉀-醋酸緩沖溶液中進行活化。取菌液10 mL置于10 mL纖維素酶溶液中，在50℃、pH 5.0條件下充分水解2 h，稀釋20倍后，于波長600 nm處測定吸光度值（OD600nm）。

2 結果與分析

2.1 菌體濃度與OD600nm值的線性關系

通過線性擬合得到菌體濃度（x）與OD600nm值（y）的線性關系方程式為y=1.098x+0.022 7，其相關性系數R2=0.996 8。因此，采用種子液的OD600nm值來表示其生長情況具有較高的可靠性。

2.2 木醋桿菌NUST4.2種子擴大培養條件優化響應面試驗

2.2.1 Plackett-Burman試驗結果與分析

Plackett-Burman試驗設計與結果見表2，方差分析結果見表3。

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

續表

表3 Plackett-Burman試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of Plackett-Burman experiments results

由表3可知，在6個對木醋桿菌NUST4.2 OD600nm值有影響的因素中有3個顯著性因素，分別為D、E和H，即攪拌轉速、消泡劑用量和通氣量，影響主次順序為D＞H＞E，其中攪拌轉速和通氣量對木醋桿菌NUST4.2 OD600nm值的影響呈現正效應，而消泡劑用量對木醋桿菌NUST4.2 OD600nm值的影響呈現負效應，即提高攪拌轉速、增大通氣量并減少消泡劑用量有利于提高木醋桿菌NUST4.2種子液的菌體濃度，確定3種顯著因素后進行最陡爬坡試驗。

2.2.2 最陡爬坡試驗結果與分析

在PB試驗的基礎上，確定顯著影響因素（攪拌轉速、消泡劑用量和通氣量）的爬坡方向和步長，最陡爬坡試驗設計及結果見表4。

表4 最陡爬坡試驗設計及結果Table 4 Design and results of the steepest ascent experiments

由表4可知，當攪拌轉速為240r/min、通氣量為1.6Nm3/h、消泡劑用量為0.06%時，OD600nm值最大，以此組合為中心進行中心組合試驗，以確定主要影響因素的最優水平。

2.2.3 中心組合試驗結果與分析

采用二次回歸的旋轉中心組合設計，以攪拌轉速（X1）、通氣量（X2）、消泡劑用量（X3）為自變量，以OD600nm值（Y）為響應值，進行3因素5水平的響應面優化試驗，5個水平分別為-α、-1、0、1、α（其中α=2k/4，k=3，α=1.682），中心組合試驗因素與水平見表5，結果與分析見表6，方差分析結果見表7。

表5 中心組合試驗的因素與水平Table 5 Factors and levels of central composite experiments

表6 中心組合試驗的結果與分析Table 6 Results and analysis of central composite experiments

利用Minitab軟件對表6數據進行多元回歸擬合，得出以OD600nm值為響應指標的二次回歸擬合方程：Y=0.629 2+0.028 89X1+0.039 91X2-0.012 25X3-0.012 26X12-0.017 56X22-0.03347X32+0.00250X1X2-0.02000X1X3+0.00750X2X3。由表7可知，回歸模型P值為0.01，失擬項P值＞0.01，表明模型可靠，無失擬因素存在。模型的決定系數R2=89.87%，與調整決定系數R2adj=80.76%接近，表明回歸模型的擬合效果較好。一次項X1、X2和二次項X32對結果影響極顯著（P＜0.01）；二次項X22對結果影響顯著（P＜0.05）；其他項對結果影響不顯著（P＞0.05）。

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of the regression model

經響應面優化得出，木醋桿菌NUST4.2種子擴大培養的最優條件為攪拌轉速257 r/min，通氣量為1.72 Nm3/h，消泡劑用量0.054%。在此優化條件下，OD600nm值最大，理論值為0.681。

2.3 驗證試驗

在給定的最優條件下，即攪拌轉速257 r/min，通氣量1.72 Nm3/h，消泡劑用量0.054%，木醋桿菌培養36 h后，OD600nm值為0.70，與回歸模型的預測值接近，說明模型的擬合比較理想，證實了模型的有效性。

3 結論

本研究應用Plackett-Burman設計試驗，快速有效地從6個影響種子擴大培養的因素中篩選出3個顯著性影響因素：攪拌轉速、通氣量和消泡劑用量。然后利用最陡爬坡法逼近最大響應值區域，并用中心組合設計得出最優培養條件：裝液量70%、初始pH值6.0、攪拌轉速257 r/min、消泡劑用量0.054%、罐壓0.2 MPa、通氣量1.72 Nm3/h。在最優培養條件下，種子擴大培養的菌體密度OD600nm值為0.70，較優化前提高10%。