響應面法優化西藏黃牛源產纖維素酶菌株發酵條件

張慶芳，王澤坤，姜 南，于 爽，遲乃玉*

（1.大連大學 生命科學與技術學院，遼寧 大連 116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術研究中心，遼寧 大連 116622）

地球分布著豐富的綠色資源，纖維素（cellulose）約占整個植物干質量的50%，是植物細胞壁的主要組成，所以纖維素的生產在地球上分布廣泛[1-5]。纖維素酶（cellulase）是降解纖維素以產生葡萄糖的一組酶的總稱。它是一種協同多組分酶系統，是一種復合酶，主要由內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶組成。

由于反芻動物主要食物來源為綠色植物，因此纖維素是反芻動物的主要能量來源。瘤胃作為反芻動物消化食道中最重要的部位，也是進行消化最重要的復胃，因此，瘤胃中的纖維素降解菌則是反芻動物對粗纖維進行消化的重要執行者[6-9]。從動物瘤胃篩選產纖維素酶菌株優點是菌株來自動物本源，因此，在之后的工業生產酶制劑和益生菌制劑更加適合動物本身，酶制劑特性更加符合動物胃腸道的消化過程，益生菌制劑更加容易在動物胃腸道定植。

響應面法（response surface methodology，RSM）在多種發酵優化方法里是一種尋找多因素系統中最佳發酵條件的統計方法，響應面法由于用擬合面的方式來完成，且更加直觀和清晰。而且具有試驗次數少、周期短、效率精度高等優點，因此，已被廣泛應用于生化反應，發酵過程優化[10-12]。

因為西藏地區特殊的生態環境特點（海拔高、溫度低和含氧量低），使西藏黃牛耐寒、耐低氧能力突出，并且瘤胃中的各類微生物產纖維素酶的能力較高。由于其地理環境和生態環境的限制，西藏地區各類產業尤其農牧業發展一直較為緩慢，而當地經濟中農牧業占很大比例。因此，如何促進西藏地區農牧業發展是為當務之急。本研究從西藏黃牛瘤胃中分離出一株纖維素酶高產菌類芽孢桿菌（Paenibacillus）菌株N30，通過單因素試驗和響應面設計試驗優化其發酵條件，首先基于Plackett-Burman（PB）試驗設計找出重要影響因子，進而通過Design Expert.V8.0.6軟件中響應面Box-Behnken（BB）試驗設計對響應過程變量進行數學建模及研究，進一步優化響應因子，確定最優發酵條件，為提高纖維素酶的活力，從而為該纖維素酶更深入研究及中試生產奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

類芽孢桿菌（Paenibacillus）N30：從西藏娟姍純種繁育示范基地的4.5歲雌性黃牛瘤胃中篩選得到，保藏在遼寧省海洋微生物工程技術研究中心。

1.1.2 主要試劑

酵母粉、胰蛋白胨、羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose-Na，CMC-Na）、牛肉膏、MgSO4·7H2O、瓊脂粉、氯化鈉、KH2PO4、（NH4）2SO4：生物工程（上海）股份有限公司。試驗所用化學試劑均為分析純或生化試劑。

1.1.3 培養基

種子培養基：蛋白胨5 g，CMC-Na 10 g，KH2PO42 g，（NH4）2SO41 g ，MgSO4·7H2O 1 g，FeSO4·7H2O 10 mg，NaCl 3 g，MnSO4·H2O 5 mg，pH7.0，蒸餾水定容至1 000 mL。

發酵培養基：蛋白胨2 g，酵母膏1 g，CMC-Na 20 g，KH2PO42 g，MgSO4·7H2O 1 g，（NH4）2SO42 g，FeSO4·7H2O 10mg，MnSO4·H2O 5mg，NaCl 3g，蒸餾水定容至1000mL。

1.2 儀器與設備

HZP-250全溫振蕩培養箱：上海精宏實驗設備有限公司；LTI-700低溫恒溫培養箱：上海愛朗儀器有限公司；UV-2102C紫外可見分光光度計：尼柯儀器科技有限公司；LDZX-40BI立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

在無菌環境中將斜面保藏的菌株N30接種于發酵培養基中，37℃、160 r/min培養24 h作為種子液。

1.3.2 粗酶液的制備

將種子液按照2%（V/V）的接種量接種到液體發酵培養基中，并在37℃、160 r/min條件下進行培養，將發酵液在4℃、4000r/min離心15min，棄去沉淀，收集上清作為粗酶液。

1.3.3 酶活測定方法

（1）葡萄糖標準曲線的繪制：取7支試管，分別加入2.0mg/mL葡萄糖標準溶液0、0.2mL、0.4mL、0.6 mL、0.8mL、1.0 mL、1.2 mL和蒸餾水2.0 mL、1.8 mL、1.6 mL、1.4 mL、1.2 mL、1.1 mL、0.8 mL，向各試管中加入DNS 2.0 mL后在100℃水浴中加熱2 min以顯色，加熱后即刻用流水迅速冷卻，并用蒸餾水補充至15 mL。混合后，在波長540 nm處測定OD540nm值，以葡萄糖含量（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

（2）纖維素酶活力的測定：制備A和B管并加入1.8 mL 1%羧甲基纖維素鈉（用pH 4.8、0.2 mol/L乙酸緩沖液配制）。使用A管作為測定管，添加0.2mL酶溶液，B管作為空管。將A和B管放于50℃恒溫水浴中60 min。結束后取出，快速加入2mL DNS溶液至管中，然后加入0.2 mL酶溶液至B管中，再水溶10 min，快速用流水冷卻，加入蒸餾水補充使用B管至零點。用分光光度計在波長540nm條件下測量OD540nm值。纖維素酶活力定義：1 min水解底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個活力單位（U）。

1.3.4 菌株N30產纖維素酶發酵條件優化單因素試驗

碳源、氮源優化：分別在發酵培養基中加入CMC-Na、麩皮、秸稈粉、葡萄糖及蔗糖作為碳源，添加量為2%；分別在發酵培養基中加入蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、（NH4）2SO4及尿素作為氮源，添加量為0.7%。在37℃、160 r/min條件下培養72 h，按照酶活測定方法測定酶活，考察碳源、氮源種類對菌株N30產纖維素酶的影響。每個處理做3個平行。

麩皮添加量為1.0%～3.0%（梯度為0.5%）、蛋白胨添加量為0.3%～0.7%（梯度為0.1%）、培養基初始pH值為5.0～9.0（梯度為1）、發酵溫度為31～43℃（梯度為3℃）、接種量為0.5%～2.5%（梯度為0.5%）、轉速為130～170 r/min（梯度為10 r/min）、裝液量為75～175 mL/250 mL（梯度為25 mL/250 mL）、種齡為16～48 h（梯度為8 h）、KH2PO4添加量為0.1%～0.5%（梯度為0.1%）。在37℃、160 r/min條件下培養72 h，按照酶活測定方法測定酶活。每個處理做3個平行。

1.3.5 Plackett-Burman設計

在單因素試驗的基礎上，選取9個影響因子作為研究目標，以纖維素酶酶活（Y）為響應值，進行Plackett-Burman（PB）試驗設計，PB試驗設計的因素與水平見表1。

表1 PB試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of PB experiments design

1.3.6 最陡爬坡試驗設計

通過Plackett-Burman試驗結果中各個顯著影響因素效應的大小來設定步長及變化方向，尋找峰值，迅速接近最佳值區域。

1.3.7 中心組合試驗設計

通過最佳爬坡試驗結果，將酶活最高的一組數值作為中心組合試驗中心點，使用Minitab15軟件進行Box-Behnken試驗設計，運用響應面分析法對產酶條件參數進行優化分析。使用Minitab 15軟件分析得到最優結果，最后對預測值進行驗證。每個處理做3個平行。Box-Behnken試驗設計因素與水平見表2。

表2 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

2 結果與分析

2.1 菌株N30產纖維素酶發酵條件優化單因素試驗

2.1.1 碳源的確定

圖1 不同碳源對纖維素酶酶活的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on cellulase activity

由圖1可知，當麩皮為唯一碳源時，纖維素酶酶活最高達17.1 U/mL，秸稈粉次之。因此，菌株N30發酵產纖維素酶的最佳碳源為麩皮。

2.1.2 麩皮添加量的確定

圖2 麩皮添加量對纖維素酶酶活的影響Fig.2 Effects of bran addition on cellulase activity

由圖2可知，當麩皮添加量為1.0%～2.5%時纖維素酶酶活逐漸升高，在麩皮添加量為2.5%時最大，為19.6 U/mL，麩皮添加量＞2.5%之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發酵產纖維素酶最佳麩皮添加量為2.5%。

2.1.3 氮源的確定

圖3 不同氮源對纖維素酶酶活的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on cellulase activity

由圖3可知，當蛋白胨作為唯一氮源時，纖維素酶酶活最大，為15.4 U/mL，牛肉膏、酵母粉次之，當硫酸銨、尿素為唯一氮源時，纖維素酶酶活較低，可見菌株主要利用有機氮源。因此，菌株N30發酵產纖維素酶的最佳氮源為蛋白胨。

2.1.4 蛋白胨添加量的確定

圖4 蛋白胨添加量對纖維素酶活的影響Fig.4 Effect of peptone addition on cellulase activity

由圖4可知，當蛋白胨添加量為0.3%～0.5%時，酶活逐漸增大，酶活在添加量為0.5%時達到最大，為16.7 U/mL，當蛋白胨添加量＞0.5%之后，酶活逐漸降低。因此，菌株N30發酵產纖維素酶最佳蛋白胨添加量為0.5%。

2.1.5 初始pH值的確定

圖5 培養基初始pH對纖維素酶活的影響Fig.5 Effect of initial pH of medium on cellulase activity

由圖5可知，當初始pH值為5.0～7.0時酶活逐漸增大，在pH值為7.0時酶活最大，為17.6 U/mL，當初始pH值＞7.0時酶活逐漸降低。因此，菌株N30發酵產纖維素酶最佳初始pH值為7.0。

2.1.6 發酵溫度的確定

圖6 發酵溫度對纖維素酶酶活的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on cellulase activity

由圖6可知，當發酵溫度為31～37℃時，纖維素酶酶活隨發酵溫度增加逐漸增大，當發酵溫度為37℃時，纖維素酶酶活最大，為17.3U/mL，當發酵溫度＞37℃之后，纖維素酶酶活降低。因此，菌株N30發酵產纖維素酶最佳發酵溫度為37℃。

2.1.7 接種量的確定

圖7 接種量對纖維素酶酶活的影響Fig.7 Effect of inoculum on cellulase activity

由圖7可知，當接種量為0.5%～1.5%時，纖維素酶酶活逐漸增大，當接種量為1.5%纖維素酶酶活最大，為16.3 U/mL，當接種量＞1.5%之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發酵產纖維素酶最佳接種量為1.5%。

2.1.8 轉速的確定

由圖8可知，當轉速為130～150 r/min時，纖維素酶酶活隨轉速的升高逐漸升高，當轉速為150 r/min時，纖維素酶酶活最大，為16.6 U/mL，當轉速＞150 r/min之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發酵產纖維素酶最佳轉速為150 r/min。

圖8 轉速對纖維素酶酶活的影響Fig.8 Effect of rotational speed on cellulase activity

2.1.9 裝液量的確定

圖9 裝液量對纖維素酶酶活的影響Fig.9 Effect of liquid loading volume on cellulase activity

由圖9可知，當裝液量為（75～125）mL/250mL時，纖維素酶酶活逐漸增加，當裝液量為125 mL/250 mL時，纖維素酶酶活最大為16.4 U/mL，當裝液量＞125 mL/250 mL之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發酵產纖維素酶最佳裝液量為125mL/250mL。

2.1.10 種齡的確定

圖10 種齡對纖維素酶酶活的影響Fig.10 Effect of seed age on cellulase activity

由圖10可知，當種齡為16～32 h時，纖維素酶酶活逐漸增大，當種齡為32 h時，纖維素酶酶活最大，為15.6 U/mL，當種齡＞32h之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發酵產纖維素酶最佳種齡為32 h。

2.1.11 KH2PO4添加量的確定

圖11 KH2PO4添加量對纖維素酶酶活的影響Fig.11 Effect of KH2PO4 addition on cellulase activity

由圖11可知，當KH2PO4添加量為0.1%～0.2%時，纖維素酶酶活逐漸增加，當KH2PO4添加量為0.2%時，纖維素酶酶活最大，為17.1 U/mL，當KH2PO4添加量＞0.2%之后，纖維素酶酶活逐漸降低。因此，菌株N30發酵產纖維素酶最佳KH2PO4添加量為0.2%。

2.2 Plackett-Burman設計篩選顯著因子[13-16]

在單因素試驗的前提上，設計Plackett-Burman（N=12）試驗，對影響纖維素酶發酵中9個因素的顯著性進行研究。試驗的設計及結果見表3，利用Minitab15軟件進行主效應分析，結果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗結果Table 3 Results of Plackett-Burman experiments

由表4可知，麩皮、發酵溫度、蛋白胨的P值分別為0.004、0.005、0.026，由于這3個因素的P值均＜0.05，所以這3個因素對試驗結果的影響均＞95%，達到顯著水平，在所選因素中對試驗結果影響最大，其中麩皮、發酵溫度具有正效應，蛋白胨具有負效應。因此，選麩皮添加量、發酵溫度、蛋白胨添加量進行最陡爬坡試驗。

表4 Plackett-Burman試驗設計的各因素水平及顯著性分析Table 4 Factors,levels and significance analysis of Plackett-Burman experiments design

2.3 最陡爬坡試驗

最陡爬坡試驗是為了確定顯著影響因素的取值逼近中心點以及提高纖維素酶的產量，麩皮添加量（X1）、蛋白胨添加量（X2）及發酵溫度（X3）這3個因素的變化方向和步長的試驗設計及結果見表5。由表5可知，3個顯著影響因素的中心點在第2組試驗附近，因此，確定以第2組的數據作為響應面試驗的中心點，即麩皮添加量（X1）、蛋白胨添加量（X2）及發酵溫度（X3）分別為2.50%，0.50%和37℃。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiments

2.4 響應面試驗設計

利用上述Plackett-Burman試驗結果，在PB試驗和最陡爬坡試驗確定的3因素3水平的基礎上，以纖維素酶活（Y）為響應值，響應面試驗設計及結果見表6。

運用Minitab15軟件對表6試驗數據進行回歸模型方差分析，結果見表7。對各因素進行二次多項式回歸擬合后，得到回歸方程如下：

由表7可知，該回歸模型的影響達到極顯著水平（P＜0.01），其自變量X1、X2、X3、X32對響應值影響極顯著（P＜0.01），二次項X12、X22對結果影響顯著（P＜0.05），其他項影響均不顯著（P＞0.05）。失擬項表示所用模型與試驗的擬合程度，該設計失擬項P值為0.110＞0.05不顯著，因而無失擬因素存在。回歸方程的決定系數R2=0.960 8＞0.9，校正決定系數為0.931 7＞0.9，表明響應值變化有93.17%來自所選變量，說明模型擬合度較好，該回歸方程可用于代替試驗真實點對試驗結果進行初步分析和預測[17-20]。

表6 Box-Behnken試驗設計及結果Table 6 Design and results of Box-Behnken experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

經Minitab15分析獲得酶活預測值最大時對應的發酵條件為麩皮添加量2.81%，蛋白胨添加量0.53%，發酵溫度38.67℃，預測最大酶活為46.7U/mL。為了便于實際操作，將發酵條件修改為麩皮添加量2.8%，蛋白胨添加量0.5%，發酵溫度38℃，驗證試驗做3次平行，平均酶活為42.5 U/mL，與理論值符合，證明采用響應面法優化得到的最佳發酵條件有效可行。優化后酶活是優化前（12.1 U/mL）的3.5倍。

3 結論

本實驗對類芽孢桿菌N30產纖維素酶發酵條件進行優化。在單因素試驗前提上，采用Plackett-Burman試驗得出麩皮添加量、蛋白胨添加量、發酵溫度是最重要的3個影響菌株N30產纖維素酶的因素，利用Box-Behnken模型對類芽孢桿菌N30發酵生產纖維素酶的產酶條件進行響應面優化，進行回歸模型方差分析后證明模型擬合度良好。單因素優化結果為麩皮添加量2.5%、蛋白胨添加量0.5%、初始pH7.0、發酵溫度37℃、接種量1.5%、轉速150 r/min、裝液量125 mL/250 mL、種齡32 h、KH2PO40.2%。響應面優化后發酵條件為麩皮添加量2.8%，蛋白添加量胨0.5%，發酵溫度38℃。在此優化條件下酶活為42.5 U/mL，是優化前酶活（12.1U/mL）的3.5倍。

菌株N30來自于西藏黃牛瘤胃，與其他從西藏地區動物胃腸道中篩選得到的產纖維素酶菌株相比酶活較高[21-22]，并且與從其他來源菌株所產纖維素酶相比更加適應當地畜牧業，酶制劑特性更加符合動物胃腸道的消化過程，在之后用作生產酶制劑的潛力更大。因此，菌株N30的發酵條件優化研究可為后續發酵放大至工業生產提供基礎與依據。