堿法預處理玉米芯糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒精工藝優(yōu)化

劉 彬，連 戰(zhàn)，劉仲洋，趙榮文，楊 莉，張秀爽，譚麗萍，劉同軍*

（齊魯工業(yè)大學（山東省科學院）生物工程學院，山東 濟南 250353）

玉米是我國重要的糧食作物，種植廣泛。玉米的大范圍種植也產(chǎn)生了以玉米秸稈、玉米芯為代表的數(shù)量龐大的農(nóng)業(yè)廢棄物[1]。據(jù)農(nóng)業(yè)部調(diào)查結(jié)果顯示，我國每年玉米秸稈產(chǎn)量高達2.65億t，玉米芯的年產(chǎn)量4 000萬t以上，合理利用這些廢棄物尤為重要[2-3]。

玉米芯中有較高的纖維素與半纖維素含量[3-5]，經(jīng)一定預處理及酶解后可有效實現(xiàn)玉米芯轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖及燃料乙醇的目的[6-8]。不同預處理方法預處理效果不同[9-11]，利用堿過氧化氫（alkaline hydrogen peroxide，AHP）法預處理能有效破壞木質(zhì)纖維素的結(jié)構(gòu)[12-13]，增加纖維素酶素與纖維素的有效接觸和催化水解率[14-15]，提高纖維素及半纖維素酶解效率。同時，選擇合適的體系、pH有助于促進纖維素酶與半纖維素酶的催化作用[16-17]，提高酶解轉(zhuǎn)化率。此外，不同的發(fā)酵方式會對酒精產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率造成很大的影響[18-19]。本研究在堿過氧化氫法預處理的技術(shù)上，對酶解pH、底物濃度、酶解溫度及酶解時間等影響玉米芯糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒精工藝的因素進行探討，并對玉米芯發(fā)酵產(chǎn)酒精不同方式的發(fā)酵工藝進行了研究，旨在為玉米芯發(fā)酵酒精提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米芯：山東德州龍力生物科技有限公司；硫酸、過氧化氫（H2O2）（均為分析純）：萊陽經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)精細化工廠；NaOH（分析純）：天津博迪化工股份有限公司；纖維素酶（192 mg/mL）：丹麥諾維信公司。

1.2 儀器與設備

PB-10 pH計：德國賽多利斯公司；MQD-B3NR恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海旻泉儀器有限公司；LC-20A液相色譜儀：日本島津公司；DHG-9075A電熱鼓風干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；5804R離心機：德國Eppendorf公司；SQ510C滅菌鍋：日本Yamato公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 堿法預處理玉米芯糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒精工藝流程

玉米芯→粉碎→熱水處理→堿處理→酶解→發(fā)酵

1.3.2 操作要點

玉米秸稈熱水處理：稱取一定量玉米芯于1000mL三角瓶中，設計底物濃度為10%，稱取3.00g NaOH顆粒于燒杯中，用10mL蒸餾水溶解，攪拌均勻后將NaOH溶液倒入三角瓶，添加蒸餾水290 mL。置于80℃水浴鍋中浸提60 min，之后去掉液體部分，固體部分用蒸餾水沖洗至中性，風干備用。

堿過氧化氫預處理：設計底物濃度為10%，稱取一定量經(jīng)熱水處理的玉米芯于50 mL三角瓶中。稱取0.30 g NaOH顆粒于燒杯中，10mL蒸餾水溶解，加入0.9mL 30%H2O2溶液（添加量0.1 g/g玉米芯），混勻后倒入三角瓶中，繼續(xù)加入蒸餾水19.1 mL。置于30℃、170 r/min條件下振搖24 h，每隔2 h用5 mol/L NaOH調(diào)節(jié)一次，使pH保持在11.7～11.9。

酶解：稱取3.0 g玉米芯于50 mL三角瓶中，堿預處理后用72%H2SO4調(diào)節(jié)酶解初始pH，添加一定量纖維素酶，在一定酶解溫度條件下酶解一定時間。

發(fā)酵：準確稱取15.0 g熱水處理玉米芯，堿預處理后加入0.5%蛋白胨，115℃滅菌20 min，添加一定量纖維素酶，在一定酶解溫度條件下酶解一定時間，接種干酵母，置于一定溫度條件下發(fā)酵一定時間。

1.3.3 玉米芯酶解工藝優(yōu)化

（1）玉米芯酶解加酶量的選擇

稱取3.0g玉米芯于50mL三角瓶中，堿預處理完畢后用72%H2SO4調(diào)節(jié)pH至5.0，纖維素酶的添加量分別為5 mg/g、10mg/g、15mg/g、20mg/g、30mg/g、50mg/g，50℃酶解24h，考察酶添加量對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響。

（2）玉米芯酶解初始pH的選擇

稱取3.0 g玉米芯于50 mL三角瓶中，堿預處理完畢后分別調(diào)節(jié)初始pH至4.6、4.8、5.0、5.2、5.5，纖維素酶添加量為20 mg/g，50℃酶解24 h，考察酶初始pH對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響。

（3）玉米芯酶解不同底物濃度的選擇

稱取3.0 g玉米芯于50 mL三角瓶中，堿預處理后用72%H2SO4調(diào)節(jié)初始pH至5.2，添加纖維素酶20 mg/g，分別在酶解底物濃度為5%、10%、15%、20%、25%、30%條件下，50℃酶解24 h，考察酶解底物濃度對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.5 不同發(fā)酵方式對乙醇產(chǎn)量的影響

分步發(fā)酵：稱取熱水處理玉米芯玉米芯15.0 g，按照上述實驗方法酶解后，離心去除固形物。上清液加0.5%蛋白胨后115℃滅菌20 min，干酵母接種量為底物質(zhì)量的5%，置于30℃、170 r/min條件下振蕩發(fā)酵80 h，測定葡萄糖、木糖及乙醇產(chǎn)量并計算其轉(zhuǎn)化率。

半同步發(fā)酵：準確稱取15.0 g熱水處理玉米芯，堿預處理后加入0.5%蛋白胨115℃滅菌20 min，加酶20 mg/g纖維素50℃酶解4 h后，按照底物質(zhì)量的5%接種干酵母，置于30℃、170 r/min條件下振蕩發(fā)酵80 h，測定葡萄糖、木糖及乙醇產(chǎn)量并計算其轉(zhuǎn)化率。

同步發(fā)酵：準確稱取15.0 g熱水處理玉米芯，堿預處理后加入0.5%蛋白胨115℃滅菌20 min。加酶20 mg/g纖維素，干酵母接種量為底物質(zhì)量的5%，置于30℃、170 r/min發(fā)酵條件下振蕩發(fā)酵80 h，測定葡萄糖、木糖及乙醇產(chǎn)量并計算其轉(zhuǎn)化率。

1.3.6 分析檢測

纖維素、半纖維素及木質(zhì)素測定參照美國國家可再生能源實驗室（National Renewable Energy Laboratory，NREL）的測定標準《生物質(zhì)中結(jié)構(gòu)碳水化合物和木質(zhì)素的測定》[20]；葡萄糖、木糖及乙醇濃度使用高效液相色譜進行測定，其色譜條件為：色譜柱Aminex-87 H色譜柱（300 mm×7.8 mm），檢測器為示差-折光檢測器，流動相為0.005 mol/L H2SO4，柱溫65℃，流速0.6 mL/min，通過建立標準曲線回歸方程對糖濃度及乙醇濃度進行計算，葡萄糖、木糖及乙醇轉(zhuǎn)化率計算公式如下：

式中：X、Y、Z分別為葡萄糖、木糖及乙醇轉(zhuǎn)化率，%；C1、C2、C3分別為葡萄糖、木糖及乙醇質(zhì)量濃度，g/L；V為樣品體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g；w1為纖維素含量，%；w2為半纖維素含量，%；0.9為纖維素轉(zhuǎn)換為葡萄糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.88為半纖維素轉(zhuǎn)換為木糖的轉(zhuǎn)化系數(shù)；0.511為葡萄糖轉(zhuǎn)換為乙醇的轉(zhuǎn)化系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米芯成分分析

玉米芯成分分析的結(jié)果見圖1。

圖1 玉米芯成分分析Fig.1 Composition analysis of corncob

由圖1可知，玉米芯纖維素含量為38.05%，半纖維素含量為28.41%，酸不溶性木質(zhì)素含量為25.85%，此外，還有4.24%灰分及1.19%其他成分。該結(jié)果與其他的一些研究[21]得出的玉米芯成分接近。與玉米秸稈相比，玉米芯纖維素及半纖維素含量更高，不同地區(qū)、玉米的品種、成分分析的方式等差異均能導致玉米芯成分之間的差異[22]。

2.2 熱水處理玉米芯成分分析

按照1.3.2節(jié)中方法熱水處理玉米芯，分析熱水處理前后其成分的變化，結(jié)果見圖2。

圖2 熱水處理前后玉米芯成分分析比較Fig.2 Comparison of corncob composition analysis before and after hot water treatment

由圖2可知，熱水處理之后的玉米芯成分相對于未處理的玉米芯成分有很大的變化，纖維素含量為48.72%，半纖維素含量為40.37%，相對含量分別提高了28%和42%，而木質(zhì)素的相對含量降低至6.6%左右。因為熱水處理過程破壞了玉米芯中纖維素、半纖維素、木質(zhì)素之間致密的連接，打破了“鋼筋混凝土”的框架，結(jié)構(gòu)變得疏松從而增加了比表面積，更利于之后的預處理和酶解過程；另一方面，熱水處理之后，水洗可以去掉預處理液中大部分抑制物，因此可以大大提高酶解效率和乙醇產(chǎn)量。

2.3 玉米芯酶解條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 玉米芯酶解加酶量的確定

不同纖維素酶添加量對酶解效率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 不同纖維素酶添加量對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effect of different cellulase addition on conversion rate of glucose and xylose

由圖3可知，葡萄糖與木糖酶解趨勢基本一致。當纖維素酶添加量在5～20 mg/g時，葡萄糖轉(zhuǎn)化率隨加酶量增加逐漸升高，當加酶量高于20 mg/g后轉(zhuǎn)化率趨于平穩(wěn)，并在酶添加量為50 mg/g時葡萄糖轉(zhuǎn)化率達到最高值為80.60%，與酶添加量為20 mg/g時葡萄糖轉(zhuǎn)化率（77.83%）相比提高較小；而當加酶量在5～30 mg/g時，木糖轉(zhuǎn)化率隨加酶量增加逐漸升高，加酶量高于30 mg/g后趨于平穩(wěn)，并且葡萄糖轉(zhuǎn)化率高于木糖轉(zhuǎn)化率。實驗中所用酵母只能利用葡萄糖，所以只考慮葡萄糖轉(zhuǎn)化率即可。因此，選擇纖維素酶最適添加量為20 mg/g。

2.3.2 玉米芯酶解初始pH的確定

不同酶解初始pH對酶解效率的影響結(jié)果見圖4。由圖4可知，酶解初始pH值為5.2時葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率達到最高值：葡萄糖轉(zhuǎn)化率為79.77%，比初始pH 4.8、pH 5.0和pH 5.5分別高出1.15%、0.5%和3.16%；木糖轉(zhuǎn)化率為75.01%，較初始pH 4.8、pH 5.0和pH 5.5分別高出1.24%、2.6%和3.18%。結(jié)果表明，酶解pH值為5.2時更有利于纖維素酶催化活性的發(fā)揮。因此，選擇最適酶解初始pH值為5.2。

圖4 不同酶解初始p H值對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of different enzymolysis initial pH on conversion rate of glucose and xylose

2.3.3 酶解底物濃度的確定

不同底物濃度對酶解效率的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著底物濃度在5%～30%范圍內(nèi)提高，葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率逐漸下降，且下降趨勢呈非線性關(guān)系。在5%底物濃度下，葡萄糖及木糖轉(zhuǎn)化率分別為88.74%、82.89%，但葡萄糖與木糖濃度則分別為17.73 g/L、12.65 g/L，處于相對較低的水平。10%底物濃度時，葡萄糖和木糖濃度較高，其轉(zhuǎn)化率與底物濃度為5%時相差不大。底物濃度提高至20%時，而葡萄糖與木糖濃度則分別達到了56.41 g/L、40.08 g/L，處于相對較高的水平，但葡萄糖及木糖轉(zhuǎn)化率降低至71.12%，66.17%。底物濃度升高，轉(zhuǎn)化率降低是因為體系水分活度的降低，不利于傳質(zhì)作用，酶蛋白不能和底物充分接觸；另外底物濃度提高會導致酶抑制物濃度的升高及高糖產(chǎn)物的反饋抑制，從而纖維素酶酶活降低，最終影響轉(zhuǎn)化率。這與之前的研究[3，23]，玉米秸稈不同底物濃度下酶解液葡萄糖與木糖濃度及轉(zhuǎn)化率趨勢基本一致，但是糖轉(zhuǎn)化率稍有不同，可能是因為原料和原料預處理方法不同造成的。因此，選擇最適酶解底物濃度為10%。

圖5 不同底物濃度對葡萄糖和木糖轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effect of different substrate concentration on conversion rate of glucose and xylose

2.4 玉米芯不同發(fā)酵方式對乙醇產(chǎn)量的影響

不同發(fā)酵方式對玉米芯糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化酒精的影響，結(jié)果見表1。由表1可知，3種發(fā)酵方式之間酒精產(chǎn)量沒有顯著差別。70 h時，半同步發(fā)酵酒精產(chǎn)量要高于其他兩種方式，發(fā)酵時間達到80 h時，分步發(fā)酵酒精產(chǎn)量16.84 g/L，同步發(fā)酵和半同步發(fā)酵酒精產(chǎn)量相近，但都比分步發(fā)酵產(chǎn)量低0.6 g/L左右。原因是后兩種發(fā)酵方式酶解過程不徹底，發(fā)酵液中還存在未酶解的纖維素，葡萄糖含量少所以酒精產(chǎn)量稍低。王許濤等[24]使用稀酸預處理稻草，同步糖化發(fā)酵108 h，乙醇含量為11.16 g/L，酒精得率低于本研究結(jié)果，且其理論酒精轉(zhuǎn)化率僅為40%，明顯低于本實驗的轉(zhuǎn)化率，這可能與預處理方法的選擇有直接關(guān)系。

表1 玉米芯不同方式發(fā)酵酒精產(chǎn)量Table 1 Alcohol yield of corn cob fermented in different ways

3 結(jié)論

堿法預處理玉米芯能有效提高酶解轉(zhuǎn)化率，50℃酶解時間24 h，在底物濃度為10%，纖維素酶添加量為20 mg/g，初始pH值為5.2時，玉米芯酶解葡萄糖轉(zhuǎn)化率達到85%以上，木糖轉(zhuǎn)化率達到80%以上。對預處理后的玉米芯30℃進行糖化24h發(fā)酵80h，分步糖化發(fā)酵中，酒精產(chǎn)量為16.84g/L，為酒精轉(zhuǎn)化率理論值的61.9%；半同步糖化發(fā)酵和同步糖化發(fā)酵酒精產(chǎn)量也分別達到了16.23 g/L和16.19 g/L，有效實現(xiàn)了利用玉米芯轉(zhuǎn)化酒精的目的，但熱水處理后發(fā)酵方式對酒精產(chǎn)量影響較低。