高產(chǎn)L-精氨酸谷氨酸棒狀桿菌的構(gòu)建

王 婷，蔡檸勻，張德志，趙桂紅，徐慶陽(yáng)，2，3，陳 寧，2，3*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.天津科技大學(xué) 代謝控制發(fā)酵技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；3.天津科技大學(xué) 教育部工業(yè)發(fā)酵微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

L-精氨酸（L-arginine）屬于堿性氨基酸，是人體半必需氨基酸，其在生物體內(nèi)具有重要的生理功能[1-5]，如治療心血管疾病、調(diào)節(jié)激素分泌、促進(jìn)生殖系統(tǒng)發(fā)育、提高免疫力等，在食品、藥品、化妝品行業(yè)廣泛應(yīng)用，市場(chǎng)需求量大。

L-精氨酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法[6]?；瘜W(xué)法合成精氨酸過(guò)程復(fù)雜，會(huì)產(chǎn)生有毒物質(zhì)污染環(huán)境，而微生物發(fā)酵法具有環(huán)保、反應(yīng)條件溫和和生產(chǎn)過(guò)程穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。隨著谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）全基因組測(cè)序及基因功能注釋的完善，通過(guò)基因工程手段定向改造C.glutamicum生產(chǎn)氨基酸越來(lái)越受重視。目前，已有許多菌株重構(gòu)、改良菌株生產(chǎn)特性、提高L-精氨酸產(chǎn)量的相關(guān)報(bào)道。占米林[7]通過(guò)串聯(lián)表達(dá)pntAB和ppnK基因?qū).glutamicum SNK118關(guān)鍵輔酶進(jìn)行調(diào)節(jié)，解除argR和farR反饋?zhàn)瓒簦琇-精氨酸的積累量為67.01 g/L，糖酸轉(zhuǎn)化率為0.35 g/g；PARK S H等[8]將C.glutamicum AR1中的阻遏蛋白基因argR和farR敲除后，L-精氨酸的積累量提高到61.9g/L；DOUW等[9]采用質(zhì)粒過(guò)表達(dá)的方式在C.crenatum SYPA5-5中過(guò)表達(dá)關(guān)鍵基因argJ，使L-精氨酸的產(chǎn)量提高16.8%；IKEDA M等[10]敲除C.glutamicum ATCC 13032中的argR基因，過(guò)表達(dá)定點(diǎn)突變的argB基因，L-精氨酸產(chǎn)量增加到52.0 g/L。

本研究以一株高產(chǎn)L-精氨酸的誘變谷氨酸棒狀桿菌AJC為出發(fā)菌株，采用基因組編輯技術(shù)[11]，首先敲除阻遏蛋白ArgR和FarR，解除反饋?zhàn)瓒簦蝗缓笄贸樗崦摎涿妇幋a基因ldh和整合鳥(niǎo)氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼基因argJ，阻斷乳酸合成途徑和增加前體物的生成；最后敲除谷氨酸分泌蛋白編碼基因NCgl1221和整合乙酰谷氨酸激酶編碼基因argB，獲得高產(chǎn)L-精氨酸C.glutamicum重組菌株。目前已報(bào)道的L-精氨酸生產(chǎn)菌株多是用質(zhì)粒過(guò)表達(dá)關(guān)鍵基因的方式，但質(zhì)粒的存在會(huì)造成菌株產(chǎn)酸穩(wěn)定性差、抗生素殘留及操作復(fù)雜的問(wèn)題。因此本研究開(kāi)發(fā)的無(wú)質(zhì)粒高產(chǎn)氨基酸生產(chǎn)菌株將具有良好的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

本研究所用菌株見(jiàn)表1。

表1 本研究所用菌株Table 1 Strains used in the study

1.1.2 引物

本研究所用引物序列見(jiàn)表2。

表2 本研究所用引物Table 2 Primers used in the study

續(xù)表

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 5 g/L，121℃滅菌20 min。

腦心浸液培養(yǎng)基（brian heart infusion，BHI）：腦心浸液37.5 g/L，121℃滅菌20 min。

活化斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏10.0 g/L，酵母粉5.0 g/L，NaCl 2.5 g/L，瓊脂20.0 g/L，玉米漿15.0 mL/L，pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖35.0g/L，玉米漿30.0mL/L，酵母粉5.0g/L，豆粕水解液20.0mL/L，KH2PO41.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，VB11.0 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH 0.2 mg/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100.0 g/L，玉米漿35.0 mL/L，（NH4）2SO410.0 g/L，豆粕水解液25.0 mL/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.7 g/L，VB11.0 mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 10 mg/L，MnSO4·H2O 10 mg/L，VH 0.1 mg/L，pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌20 min。

BHIS復(fù)蘇液：腦心浸液37.5 g/L，葡萄糖 5 g/L，115 ℃滅菌15 min。

1.1.4 試劑

Primer STARHS脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）polymerase（2.5 U/μL）、QuickCut限制性內(nèi)切酶（120 U/μL）：大連寶生物工程有限公司；Taq聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）MasterMix、Clone ExpressRⅡOne Step Cloning Kit：南京諾維贊生物工程有限公司；質(zhì)粒提取及DNA回收試劑盒：上海Omega Bio-tek公司；質(zhì)粒pK18mobrpsl：本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 儀器與設(shè)備

Mastercycler nexus PCR儀、Eppendorf Eporator電擊轉(zhuǎn)化儀：德國(guó)Eppendorf公司；GL20A高速冷凍離心機(jī)：日本日立有限公司；UV200紫外可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器：美國(guó)Laballiance公司；Agilent 1200高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技（中國(guó)）有限公司；SCD-II高純水裝置：美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

以谷氨酸棒狀桿菌基因組為模板，分別采用引物對(duì)ArgR-1和ArgR-2、ArgR-3和ArgR-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再經(jīng)重疊延伸PCR得到重疊DNA片段。使用限制性核酸內(nèi)切酶Kpn I和Xba I對(duì)質(zhì)粒pk18mobrpsl、重疊DNA片段進(jìn)行酶切后，使用Clone ExpressRⅡOne Step Cloning Kit同源重組酶連接，獲得重組質(zhì)粒pk18mobrpsl-ΔargR。PCR擴(kuò)增體系：5×PS Buffer 10 μL、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mixture（10 mmol/L）4 μL、上下游引物各2μL、DNA模板約200 ng、HS酶（5 U/μL）0.5 μL、雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)充至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；98℃變性10 s，適當(dāng)退火溫度下退火15 s，72℃延伸適當(dāng)時(shí)間（1min延伸約1kbp），30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

采用同樣的方法和模板，構(gòu)建重組質(zhì)粒pk18mobrpsl-ΔfarR（farR的上下游同源臂引物為FarR-1和FarR-2、FarR-3和FarR-4）、pK18mobrpsl-Δldh：：P tufargJ（ldh的上下游同源臂引物為L(zhǎng)DH-1和LDH-2、LDH-7和LDH-8；P tuf和argJ的上下游引物分別為L(zhǎng)DH-3和LDH-4、LDH-5和LDH-6）、pK18mobrpsl-ΔNCgl1221：：P sodargB（NCgl1221的上下游同源臂引物為B-1和B-2、B-7和B-8；P sod和argB的上下游引物為B-3和B-4、B-5和B-6）。

采用CaCl2介導(dǎo)的化學(xué)轉(zhuǎn)化法[12]將體外重組體系加至E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴20 min，42℃熱激1 min，加入900 μL的LB液體培養(yǎng)基，在37℃、220 r/min條件下復(fù)蘇1 h，涂布于添加相應(yīng)抗性的LB培養(yǎng)基平板中，37℃培養(yǎng)12 h，PCR鑒定后篩選正確轉(zhuǎn)化子，將其轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基（添加相應(yīng)抗性），37℃過(guò)夜培養(yǎng)，收集菌體，按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取重組質(zhì)粒。

1.3.2 重組菌株的構(gòu)建

菌株基因組的編輯采用pK18mobrpsl無(wú)痕編輯系統(tǒng)[11]。采用電轉(zhuǎn)化法將上述構(gòu)建的重組質(zhì)粒與谷氨酸棒狀桿菌AJC感受態(tài)細(xì)胞混合后加入電轉(zhuǎn)杯，冰浴20 min，電擊，加BHIS復(fù)蘇液，46℃水浴熱激6 min，32℃、220 r/min條件下復(fù)蘇2 h，涂布于添加相應(yīng)抗生素的BHI培養(yǎng)基的平板，32℃過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò)菌株兩輪單雙交換，PCR鑒定后篩選獲得重組菌株。

1.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

使用斜面活化培養(yǎng)基，將菌體傳代兩次。取兩環(huán)活化的菌體接種于種子培養(yǎng)基，裝液量為30 mL/500 mL，32℃、220r/min條件下培養(yǎng)12h，OD600nm值約為15。再按10%（V/V）的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為30mL/500mL，32℃、220 r/min條件下培養(yǎng)64 h，定時(shí)取樣檢測(cè)發(fā)酵液中L-精氨酸的含量。

1.3.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)

將斜面活化的菌體接于裝有60 mL種子培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，32℃、220 r/min條件下培養(yǎng)16 h作為一級(jí)種子液。再將一級(jí)種子按10%的接種量接于裝有種子培養(yǎng)基的二級(jí)種子罐（2 L）中，裝液量為1.2 L/2 L，32℃、溶氧量20%～30%條件下培養(yǎng)至OD600nm值=14，作為二級(jí)種子液。按15%的接種量將二級(jí)種子接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的5 L發(fā)酵罐中，裝液量為3 L/5 L，發(fā)酵條件同二級(jí)種子罐；連續(xù)流加25%氨水，pH約7.0；按照一定的流加速率，補(bǔ)加80%的葡萄糖溶液，殘?zhí)橇烤S持在1%～1.5%。

1.3.5 測(cè)定方法

菌體濃度的測(cè)定：在發(fā)酵過(guò)程中，定時(shí)取樣、稀釋后，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值。

葡萄糖含量的測(cè)定[13]：使用生物傳感儀測(cè)定葡萄糖含量。L-精氨酸[14]、L-谷氨酸[15]和乳酸[16]含量的測(cè)定：采用高效液相色譜法。

2 結(jié)果與分析

2.1 連續(xù)敲除基因argR和farR對(duì)L-精氨酸產(chǎn)量的影響

L-精氨酸的操縱子包含argCJBDFR和argGH兩部分，阻遏蛋白ArgR[17]會(huì)結(jié)合到這兩個(gè)操縱子上，降低這些基因的轉(zhuǎn)錄水平。此外，阻遏蛋白FarR[18]也會(huì)結(jié)合到arg的操縱子以及gdh基因的上游區(qū)域，導(dǎo)致基因表達(dá)量下降。為解除阻遏作用，增加L-精氨酸合成途徑的通量，將基因argR和farR連續(xù)敲除，構(gòu)建解除反饋?zhàn)瓒舻那贸闍JC-1和AJC-2，并以出發(fā)菌株AJC作為對(duì)照組，經(jīng)搖瓶發(fā)酵64 h后，測(cè)定發(fā)酵液中L-精氨酸的含量和菌體的OD600nm值，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 菌株AJC、AJC-1和AJC-2的OD600 nm值及L-精氨酸產(chǎn)量Fig.1 OD600 nm value and L-arginine production of strain AJC,AJC-1 and AJC-2

由圖1可見(jiàn)，與出發(fā)菌株AJC相比，菌株AJC-1和AJC-2的OD600nm值（38.5、37.0）分別降低3.8%、7.5%；L-精氨酸產(chǎn)量（28.1 g/L、30.3 g/L）分別提高6.4%和14.8%。結(jié)果表明，連續(xù)敲除基因argR和farR，重組菌株比出發(fā)菌株的生長(zhǎng)略微變慢，但L-精氨酸的產(chǎn)量有了逐步提高。由此可見(jiàn)，解除出發(fā)菌株AJC的反饋?zhàn)瓒糇饔煤?，促進(jìn)了L-精氨酸的合成。

2.2 敲除基因ldh及強(qiáng)化關(guān)鍵基因argJ對(duì)L-精氨酸產(chǎn)量的影響

乳酸是L-精氨酸合成途徑中的代謝副產(chǎn)物，乳酸的合成會(huì)消耗大量能量和前體物丙酮酸，降低L-精氨酸的產(chǎn)量。為了減少副產(chǎn)物的積累、加強(qiáng)主要代謝通路碳代謝流[19]，削弱乳酸途徑對(duì)L-精氨酸合成的關(guān)鍵前體丙酮酸的競(jìng)爭(zhēng)，可通過(guò)敲除基因ldh[20]的方式解決。此外，亦可強(qiáng)化關(guān)鍵基因argJ的表達(dá)，提高L-谷氨酸到L-精氨酸的轉(zhuǎn)化能力[21]。因此，在菌株ARG-2的基礎(chǔ)上敲除ldh，同時(shí)在該位點(diǎn)整合L-精氨酸合成的關(guān)鍵基因argJ，獲得的重組菌株ARG-3。以出發(fā)菌株AJC作為對(duì)照組，經(jīng)搖瓶發(fā)酵64 h后，測(cè)定發(fā)酵液中的L-精氨酸含量、乳酸含量和菌體的OD600nm值，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菌株AJC和AJC-3的OD600 nm值、L-精氨酸產(chǎn)量和乳酸含量Fig.2 OD600 nm value,L-arginine production and lactic acid content of strain AJC and AJC-3

由圖2可見(jiàn)，與出發(fā)菌株AJC相比，菌株AJC-3的OD600nm值（37.0）、乳酸積累量（0.1 g/L）分別下降7.5%、97.7%，L-精氨酸產(chǎn)量（32.1 g/L）提高21.6%。說(shuō)明敲除基因ldh阻斷了乳酸途徑，進(jìn)而阻止了該副產(chǎn)物的合成。由此可見(jiàn)，強(qiáng)化關(guān)鍵酶的表達(dá)，減少副產(chǎn)物途徑對(duì)碳源和前體物的消耗，對(duì)L-精氨酸的積累起到積極作用。

2.3 敲除基因NCgl1221及強(qiáng)化關(guān)鍵基因argB對(duì)L-精氨酸產(chǎn)量的影響

谷氨酸棒狀桿菌中基因NCgl1221編碼谷氨酸分泌蛋白[8]。為了減弱L-谷氨酸的胞外分泌，增加L-精氨酸發(fā)酵前體物的積累量，在菌株ARG-3的基礎(chǔ)上敲除基因NCgl1221，同時(shí)在該位點(diǎn)整合L-精氨酸的關(guān)鍵基因argB，最終達(dá)到增加L-精氨酸產(chǎn)量的目的。因此，構(gòu)建重組菌株ARG-4并進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，以出發(fā)菌株AJC作為對(duì)照組，經(jīng)搖瓶發(fā)酵64 h后，測(cè)定發(fā)酵液中的L-精氨酸含量、L-谷氨酸含量和菌體的OD600nm值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 菌株AJC和AJC-4的OD600 nm值、L-精氨酸產(chǎn)量和L-谷氨酸含量Fig.3 OD600 nm value,L-arginine production and L-glutamic content of strain AJC and AJC-4

由圖3可見(jiàn)，與出發(fā)菌株AJC相比，菌株AJC-4的OD600nm值（30.2）和L-谷氨酸的積累量（0.2 g/L）分別下降24.5%、95.2%，L-精氨酸產(chǎn)量（34.3 g/L）提高29.9%。結(jié)果表明，敲除NCgl1221基因和過(guò)表達(dá)關(guān)鍵基因argB后，有效地減少了副產(chǎn)物積累和提高了關(guān)鍵基因的表達(dá)水平，進(jìn)而提高了菌株的L-精氨酸產(chǎn)量。

2.4 谷氨酸棒狀桿菌AJC和AJC-4的分批補(bǔ)料發(fā)酵

2.4.1 菌體的OD600nm值、殘?zhí)橇亢蚅-精氨酸產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證重組菌株AJC-4生產(chǎn)L-精氨酸的能力，以出發(fā)菌株AJC為對(duì)照，對(duì)兩株菌進(jìn)行分批補(bǔ)料發(fā)酵，菌體的OD600nm值、殘?zhí)橇亢蚅-精氨酸產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

圖4 分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中菌株AJC和AJC-4的OD600 nm值、殘?zhí)橇亢蚅-精氨酸產(chǎn)量的測(cè)定結(jié)果Fig.4 Determination results of OD 600 nm value,residual sugar content and L-arginine production of strain AJC and AJC-4 during fed-batch fermentation processes

由圖4可知，分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中，對(duì)照菌株AJC和重組菌株AJC-4的OD600nm值、殘?zhí)橇亢蚅-精氨酸產(chǎn)量的變化趨勢(shì)基本相同。菌體的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為0～24 h，之后菌體的生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定；發(fā)酵0～24 h，葡萄糖含量快速下降，說(shuō)明處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體需要獲取大量的碳源，消耗大量的葡萄糖，滿足自身快速生長(zhǎng)的需要；發(fā)酵24 h后，殘?zhí)橇浚?.0%，然后通過(guò)流加80%的葡萄糖溶液，始終控制殘?zhí)橇吭?.0%～1.5%。在發(fā)酵前期（0～20 h），菌體處于生長(zhǎng)階段，L-精氨酸產(chǎn)量非常少，當(dāng)菌體生長(zhǎng)接近穩(wěn)定期后，L-精氨酸的產(chǎn)量開(kāi)始快速積累，在發(fā)酵64 h時(shí)，菌株AJC和AJC-4的L-精氨酸的產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為64 g/L、78 g/L。然而，菌株AJC-4的OD600nm值始終低于出發(fā)菌株AJC，說(shuō)明菌株在進(jìn)行基因組編輯后，一定程度上影響了菌株的生長(zhǎng)；重組菌株AJC-4消耗葡萄糖的速度明顯慢于出發(fā)菌株AJC，說(shuō)明改造后菌株可減少碳源的消耗；重組菌株AJC-4的L-精氨酸產(chǎn)量（78.0g/L）較出發(fā)菌株AJC（64.0g/L）提高了21.9%。此外，在菌株正常生長(zhǎng)的情況下，重組菌株AJC-4的糖酸轉(zhuǎn)化率為0.38 g/g，高于出發(fā)菌株AJC（0.32 g/g），提高了18.8%。

2.4.2 乳酸和L-谷氨酸含量的測(cè)定結(jié)果

菌株AJC、AJC-4在5 L發(fā)酵罐中分批補(bǔ)料發(fā)酵64 h后，測(cè)定發(fā)酵液中的乳酸和L-谷氨酸的積累量，結(jié)果如圖5所示。

圖5 分批補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程中菌株AJC和AJC-4的副產(chǎn)物積累量Fig.5 By-product accumulation of strain AJC and AJC-4 during fed-batch fermentation processes

由圖5可知，在敲除ldh和NCgl1221基因后，乳酸和谷氨酸的分泌幾乎降為零。說(shuō)明成功阻斷乳酸合成途徑和谷氨酸分泌蛋白的合成，有效地消除了副產(chǎn)物的積累和分泌。

3 結(jié)論

本研究以產(chǎn)L-精氨酸的誘變菌株谷氨酸棒狀桿菌AJC為出發(fā)菌株，通過(guò)基因敲除和基因整合，阻斷副產(chǎn)物乳酸和L-谷氨酸的積累，構(gòu)建了一株L-精氨酸高產(chǎn)菌株AJC-4。菌株AJC-4經(jīng)分批補(bǔ)料發(fā)酵64 h后，L-精氨酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別為78.0 g/L和0.38 g/g，較出發(fā)菌株AJC分別提高21.9%、18.8%；副產(chǎn)物乳酸和L-谷氨酸積累量分別為0.11g/L、0.16 g/L，較出發(fā)菌株AJC分別降低96.8%、96.1%。選育生產(chǎn)穩(wěn)定和產(chǎn)酸能力強(qiáng)的生產(chǎn)菌株具有巨大的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用潛力。