化肥減施對紫云英還田土壤活性有機碳和碳轉化酶活性的影響

李增強，張 賢，王建紅*，曹 凱，徐昌旭，曹衛東

（1 浙江省農業科學院環境資源與土壤肥料研究所，浙江杭州 310021；2 江西省農業科學院土壤肥料與資源環境研究所，江西南昌 330200；

3 中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京 100081）

土壤活性有機碳 (如可溶性有機碳、熱水提取態有機碳、微生物生物量碳、顆粒有機碳和易氧化有機碳) 是土壤中周轉時間較短，易被微生物利用的有機碳組分[1]，對作物產量、土壤養分供應以及土壤結構等有重要影響[2-4]。由于土壤活性有機碳能夠靈敏反映施肥、耕作等田間管理措施對土壤碳庫和潛在生產力的影響，常被作為評價土壤有機質早期變化和土壤肥力的一個重要指標[1-2]。紫云英 (Astragalus sinicus L.) 作為一種我國南方水稻生產區的重要綠肥，翻壓還田是提高稻田土壤肥力的傳統農業措施[5]。因此，研究施用紫云英綠肥對土壤活性有機碳的影響對于實現稻田土壤有機碳庫的正向培育，提高土壤肥力具有重要意義。目前，不同研究者關于施用綠肥對土壤活性有機碳影響的研究結果并不完全一致[6-11]。例如，高嵩涓等[6]利用31年的雙季稻—冬綠肥長期定位試驗發現，施用油菜、黑麥草和紫云英三種綠肥均能夠顯著增加土壤微生物生物量碳含量和微生物商，并且施用紫云英對微生物生物量碳的提高作用最為顯著。胡曉珊等[8]發現不同綠肥翻壓還田后溫室0—100 cm土壤剖面的可溶性有機碳含量均增加，莧科綠肥的效果低于豆科和禾本科綠肥。然而Mi等[11]利用4年田間定位試驗發現，施用紫云英綠肥對0—20 cm土層的顆粒有機碳含量無顯著影響。不同的研究結果可能與綠肥種類、田間管理措施以及土壤環境條件等不同有關。此外，Chen等[12]比較了包括綠肥在內的不同有機物料還田對稻田土壤活性有機碳含量的影響，發現紫云英綠肥還田比水稻秸稈和油菜秸稈還田更有利于增加可溶性有機碳、熱水提取態有機碳、微生物生物量碳和易氧化有機碳的含量。Williams等[13]利用13C同位素標記技術，研究了一年生黑麥草和深紅三葉草分別翻壓還田對微生物生物量碳的貢獻，發現翻壓10個月后約有30%～40%的微生物生物量碳來自于綠肥。由于綠肥碳轉化為土壤活性有機碳包括一系列復雜的土壤酶促反應過程，因此與碳轉化相關的土壤酶活性是影響土壤活性有機碳的重要因素[14-15]。Li等[15]通過逐步回歸分析發現，纖維素酶和β-葡萄糖苷酶活性是顯著影響土壤可溶性有機碳、易氧化有機碳和微生物生物量碳的正效應因子。這可能是因為這兩種酶能夠將植物中的纖維素類物質轉化為易溶于水的纖維二糖、果糖和葡萄糖等小分子成分[16]，從而有利于土壤活性有機碳的形成。紫云英綠肥中含有豐富的氮、磷、鉀等養分元素，翻壓還田后能夠減少化肥使用量[17]。目前，關于紫云英還田配施不同比例化肥對土壤活性有機碳含量和碳轉化酶活性影響的研究還不多見。本文通過田間定位試驗，研究相同紫云英還田量條件下，不同化肥配施比例對土壤活性有機碳含量和碳轉化酶活性的影響，探討碳轉化酶活性與土壤活性有機碳含量變化的關系，以期為減少稻田化肥使用、增加土壤肥力、實現土壤有機碳庫的正向培育提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗點位于浙江省金華市婺城區，在蔣堂農業科學試驗站 (119°32′12″ E，29°04′8″ N) 進行，海拔63 m，屬于中亞熱帶季風氣候，年均氣溫約18℃，年均降水量約1500 mm，全年平均日照時數約1700 h。試驗地土壤類型為紅壤黃筋泥土發育而成的水稻土，試驗前表層土壤 (0—20 cm) pH值5.38、有機質21.5 g/kg、全氮 1.45 g/kg、堿解氮 248 mg/kg、速效磷25.0 mg/kg、速效鉀 34.4 mg/kg，砂粒102 g/kg、粉粒489 g/kg和粘粒409 g/kg (中國制)。

供試紫云英 (Astragalus sinicus L.) 品種是當地主栽品種‘寧波大橋’，每年4月中旬翻壓盛花期的紫云英鮮草，其氮、磷、鉀含量分別為3.82、0.39、3.61 g/kg。供試水稻品種為‘甬優9號’，種植方式為單季稻，5月上旬育秧，6月中旬插秧。

試驗于2011年4月開始，共設7個處理：對照(CK)；單施N、P2O5、K2O化肥量分別210、56.3、112.5 kg/hm2(CF)； 翻壓 45 t/hm2紫云英鮮草 (MV)；在翻壓45 t/hm2紫云英鮮草的同時，配施20%、40%、60%和80%的常規氮磷鉀化肥量，處理代碼依次為MV + 20%CF、 MV + 40%CF、MV + 60%CF和MV + 80%CF。每個處理均設4個重復小區，小區面積為20 m2，隨機排列。為了避免紫云英根系對土壤生化性質的影響，本 試驗采用紫云英鮮草異地還田的方式進行。

單施化肥處理，于秧苗移栽的前一天基施碳酸氫銨525.0 kg/hm2、過磷酸鈣375.0 kg/hm2，分蘗初期追施尿素187.5 kg/hm2、氯化鉀112.5 kg/hm2，孕穗期追施尿素75.0 kg/hm2、氯化鉀75.0 kg/hm2。

1.2 樣品采集與測定

2016年水稻收獲后，采用多點混合采樣法采集不同處理的表層 (0—20 cm) 土壤樣品，樣品裝入塑封袋并置于冰盒中運回實驗室。在實驗室內將樣品中的石礫及動植物殘體等挑出，一部分直接過2 mm篩，然后保存在4℃冰箱中；另一部分風干后過2 mm和0.15 mm篩，備用。

土壤總有機碳 (TOC) 含量采用重鉻酸鉀外加熱法測定[18]。土壤可溶性有機碳 (DOC) 采用Jones和Willett[19]的方法進行測定。熱水提取態有機碳 (HEOC)采用Ghani等[2]的方法進行測定。土壤微生物生物量碳 (MBC) 采用氯仿熏蒸—硫酸鉀浸提法測定，以熏蒸土樣與不熏蒸土樣提取的有機碳的差值除以轉換系數Kc (0.45) 計算土壤微生物生物量碳[20]。顆粒有機碳 (POC) 采用六偏磷酸鈉溶液提取，利用重鉻酸鉀外加熱法測定其中碳含量[21]。易氧化有機碳 (ROC)采用333 mmol/L高錳酸鉀氧化法測定[22]，碳庫管理指數能夠反映土壤管理措施引起的土壤有機碳變化程度，是土壤有機碳變化的系統的、敏感的監測指標[22]，其計算公式如下：

碳庫活度=易氧化有機碳/(土壤總有機碳-易氧化有機碳) (1)碳庫活度指數=樣品碳庫活度/參考土壤碳庫活度 (2)碳庫指數=土壤總有機碳含量/參考土壤有機碳含量(3)碳庫管理指數=碳庫指數×碳庫活度指數×100% (4)

本試驗采用CK處理的土壤為參考土壤。

纖維素酶和蔗糖酶活性分別以羧甲基纖維素鈉和蔗糖為底物，采用3, 5-二硝基水楊酸比色法測定；β-葡萄糖苷酶活性以對硝基苯-β-D-葡萄糖苷為底物，采用比色法測定[23]。酚氧化酶和過氧化物酶活性以L-DOPA (L-3, 4-dihydroxyphenylalanine，左旋多巴) 為底物，采用比色法測定[24]。上述酶活性均采用新鮮土樣測定。

幾何平均酶活性 (GMEA) 是指示土壤生物質量的綜合評價指標之一，可以反映不同土壤管理措施對土壤整體酶活性的影響，其計算公式如下[25]：

式中：CEL表示纖維素酶活性；INV表示蔗糖酶活性；GLU表示β-葡萄糖苷酶活性；PHO表示酚氧化酶活性；PER表示過氧化物酶活性。

總體酶活性 (Et) 指標可以消除不同土壤酶活性的量綱及大小的影響，能更好的表征土壤中總體酶活性和肥力水平的高低，采用下面的公式計算[26]：

式中：Xi為供試土樣第i種酶活性實測值；為同種酶活性平均值。

1.3 數據處理

所得數據均以烘干土計 (105℃，24 h)。本文數據采用SPSS 16.0統計分析軟件進行方差分析以及土壤碳轉化酶活性與土壤活性有機碳含量之間通徑分析。

2 結果與分析

2.1 土壤活性有機碳和總有機碳

試驗連續進行6年后，水稻土壤活性有機碳和總有機碳含量出現顯著差異 (表1)。與CF處理相比，MV處理顯著增加土壤可溶性有機碳 (DOC)、熱水提取態有機碳 (HEOC) 和易氧化有機碳 (ROC) 含量，但兩處理的DOC、HEOC和ROC含量均顯著低于MV + 20%CF、MV + 40%CF、MV + 60%CF和MV + 80%CF處理，紫云英配施化肥處理中，隨著化肥量增加DOC、HEOC和ROC含量呈先增加后降低的趨勢，MV + 60%CF處理的含量最高。MV處理的微生物生物量碳 (MBC) 和總有機碳 (TOC) 含量較CF處理無顯著差異，兩處理的MBC和TOC含量均顯著低于MV + 20%CF、MV + 40%CF、MV + 60%CF和MV + 80%CF處理；紫云英配施化肥處理中，隨著化肥量增加MBC含量呈先增加后降低的趨勢，TOC含量無顯著變化。MV處理的顆粒有機碳 (POC) 含量顯著高于CF處理，而顯著低于MV + 60%CF處理。綜上可知，紫云英配施化肥能夠顯著增加土壤活性有機碳含量，并且隨著配施化肥量的提高呈先增加后降低的趨勢，以配施60%常規化肥量效果最佳。

不同土壤活性有機碳占總有機碳的比例不同，具體表現為 POC/TOC ＞ ROC/TOC ＞ MBC/TOC ＞HEOC/TOC ＞ DOC/TOC (表 2)。MV + 60%CF 處理的DOC/TOC值最高，顯著高于CK和CF處理，而與其他處理無顯著差異。MV處理的HEOC/TOC值最高，顯著高于CK、CF、MV + 20%CF和MV + 80%CF處理。MBC/TOC值在不同處理間無顯著差異。MV處理的POC/TOC值最高，顯著高于CK處理，而與其他處理無統計性差異。MV + 80%CF處理的ROC/TOC值最高，顯著高于CK和CF處理，而與其他處理無顯著差異。

由表3可以看出，CK處理的碳庫活度和碳庫活度指數顯著低于MV + 80%CF處理，而與CF、MV、MV + 20%CF、MV + 40%CF和MV + 60%CF處理相比無顯著差異。MV處理的碳庫指數顯著高于CK處理，而顯著低于MV + 20%CF、MV + 40%CF、MV +60%CF和MV + 80%CF處理。碳庫管理指數表現為CK ＜ CF ＜ MV ＜ MV + 20%CF ＜ MV + 40%CF ＜ MV +60%CF、MV + 80%CF 處理 (P ＜ 0.05)。

2.2 土壤酶活性

不同處理對五種土壤碳轉化酶活性、幾何平均酶活性和總體酶活性均具有顯著影響 (表4)，其中CK處理的上述指標均顯著低于其他處理。與CF處理相比，MV處理顯著增加纖維素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶活性，對酚氧化酶和過氧化物酶活性無顯著影響，兩處理的上述五種酶活性均顯著低于MV +20%CF、MV + 40%CF、MV + 60%CF和MV + 80%CF處理，紫云英配施化肥的各處理中，隨著配施化肥量的增加，上述五種酶活性呈先增加后降低趨勢，MV + 60%CF處理的酶活性最高。幾何平均酶活性和總體酶活性表現為 CK ＜ CF ＜ MV ＜ MV + 20%CF ＜ MV + 40%CF、MV + 80%CF ＜ MV + 60%CF處理 (P ＜ 0.05)。綜上可知，紫云英配施化肥能夠顯著增加土壤碳轉化酶活性，并且隨著配施化肥量的提高呈先增加后降低的趨勢，以配施60%常規化肥量效果最佳。

表 1 不同處理的土壤活性有機碳組分和總有機碳含量Table 1 Contents of soil labile organic carbon fractions and total organic carbon in different treatments

表 2 不同處理的土壤活性有機碳組分占總有機碳的比例 (%)Table 2 Ratios of soil labile organic carbon fractions to total organic carbon in different treatments

表 3 不同處理土壤碳庫管理指數 (%)Table 3 The carbon management index in different treatments

表 4 不同處理的土壤酶活性和酶活性指數Table 4 Soil enzyme activities and index of enzyme activity in different treatments

表5是酶活性與微生物生物量碳的比值，用來表征相對酶活性。MV處理的相對纖維素酶和相對蔗糖酶活性顯著高于CK和CF處理，而與MV + 20%CF、MV + 40%CF、MV + 60%CF和MV + 80%CF處理相比無顯著差異。MV處理的相對β-葡萄糖苷酶活性較CF處理無顯著差異，兩處理均顯著低于MV +40%CF、MV + 60%CF和MV + 80%CF處理。相對酚氧化酶活性在不同處理間無顯著差異。MV + 60%CF和MV + 80%CF處理的相對過氧化物酶活性顯著低于CF和MV處理，而與MV + 20%CF和MV + 40%CF處理相比無顯著差異。

2.3 通徑分析

表6表明，纖維素酶活性對HEOC具有最大的直接正效應 (0.968)，蔗糖酶活性分別對DOC和MBC表現出最大的直接正效應 (0.971和0.951) 和最小的間接效應 (0.900和0.490)，β-葡萄糖苷酶活性分別對POC和ROC表現出最大的直接正效應 (0.859和0.596)。酚氧化酶活性對DOC表現出最高的間接效應 (間接通徑系數為1.702)，而β-葡萄糖苷酶活性則對HEOC具有最高的間接效應 (間接通徑系數為1.677)，過氧化物酶活性分別對MBC、POC和ROC表現出最大的間接效應 (間接通徑系數分別為1.391，1.354和1.543)。綜上可知，纖維素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶能夠直接影響土壤活性有機碳含量，而酚氧化酶和過氧化物酶則主要起間接作用。

表 5 不同處理的土壤酶活性與微生物生物量碳的比值Table 5 The ratios of soil enzyme activities to microbial biomass carbon in different treatments

3 討論

土壤活性有機碳含量對土壤管理措施響應敏感，是指示早期土壤肥力變化的重要指標之一[1-2]。本研究發現紫云英配施化肥能夠顯著增加土壤活性有機碳含量，并且隨著配施化肥量的增加呈現先增加后降低的趨勢，MV + 60%CF處理的土壤活性有機碳含量最高。楊濱娟等[7]發現紫云英配施化肥處理的土壤ROC、MBC和DOC與單施紫云英處理無顯著差異。周國朋等[9]則發現紫云英配施化肥處理較單施紫云英處理能夠顯著增加DOC含量。不同的研究結果可能與土壤類型、當地氣候條件以及田間管理措施等不同有關。土壤活性有機碳主要來自于外源有機物料和土壤自身有機碳的分解過程[1]，紫云英綠肥中含有豐富的有機物質，進入土壤后能夠在微生物的作用下轉化為土壤活性有機碳。另外，常單娜等[27]通過翻壓3種綠肥的培養試驗發現，隨著綠肥C/N比的降低，綠肥增加土壤DOC含量的能力逐漸增加。在本研究中，混合翻壓物 (綠肥和化肥) 的C/N比隨著配施化肥量的增加而降低，有利于土壤微生物將綠肥轉化為土壤活性有機碳。然而，由于土壤活性有機碳本身也是土壤微生物的一種重要碳源[1]，隨著高量化肥施入引起的土壤養分有效性的增加，微生物會將部分土壤活性有機碳轉化為CO2釋放到空氣中，從而導致紫云英配施80%化肥條件下土壤活性有機碳含量降低。本研究還發現紫云英還田后隨著配施化肥量的增加，水稻秸稈產量逐漸增加，在配施60%化肥時達到最高[17]。隨著秸稈產量的增加，殘留在土壤中的水稻根系以及根系分泌物也會逐漸增加，從而有利于土壤活性有機碳含量的提高。

土壤活性有機碳與總有機碳的比值可用來表征土壤有機碳的活性。本研究發現紫云英配施化肥能夠顯著增加DOC/TOC值和ROC/TOC值，而對HEOC/TOC值、MBC/TOC值和POC/TOC值無顯著影響，這可能與不同活性有機碳的來源及形成過程有關。本研究結果一方面可能是因為紫云英施入土壤后，部分紫云英成分能夠快速溶于土壤溶液中，直接轉變為DOC或ROC，從而提高了活性有機碳組分的相對比例；另一方面紫云英作為一種新鮮有機物料施入土壤后能夠促進原有土壤有機碳的分解(激發效應)[28]，從而形成更多的土壤活性有機碳，增加其相對比例。然而，紫云英還田條件下化肥配施量的不同對土壤活性有機碳與總有機碳的比值無顯著影響。這可能由于增加配施化肥量能夠改善土壤養分條件，提高微生物群落活性[29-30]，從而導致土壤微生物將更多的土壤活性有機碳轉化為非活性有機碳存儲于土壤中。

土壤酶是推動土壤物質轉化和能量流動的重要動力，對土壤肥力的形成具有重要作用[23]。本研究表明紫云英配施化肥能夠顯著增加土壤碳轉化酶活性，并且隨著配施化肥量的增加，碳轉化酶活性呈先增加后降低的趨勢，MV+60%CF處理的土壤碳轉化酶活性最高。這可能與以下因素有關：第一，土壤酶活性受所催化的底物濃度的顯著影響[8]，紫云英施入土壤后能夠為相應的酶提供充足的底物，從而導致酶活性的顯著增加；第二，隨著配施化肥量的增加，水稻秸稈產量逐漸增加，在配施60%化肥時達到最高[17]，導致殘留在土壤中的根系和根系分泌物增加，從而能夠為酶提供更多的底物；第三，由于大部分酶都是土壤微生物合成和釋放的，紫云英配施化肥處理顯著增加了微生物生物量 (表1)，從而有利于碳轉化酶活性的提高。然而，配施高量 (80%)化肥會降低土壤pH值，促進鹽類物質在土壤中的累積，從而對酶活性產生抑制作用[31]，進而導致紫云英配施高量化肥條件下酶活性的降低。

表 6 土壤碳轉化酶活性對土壤活性有機碳含量的通徑系數Table 6 Path coefficients between soil C conversion enzyme activities and soil labile organic carbon contents

Allison等[32]認為用絕對酶活性與MBC的比值表征相對酶活性能夠反映土壤酶的效率。本研究發現紫云英配施化肥能夠顯著增加相對蔗糖酶和相對β-葡萄糖苷酶活性，并且隨著配施化肥量的增加，相對β-葡萄糖苷酶活性增加，而相對過氧化物酶活性顯著降低，表明不同酶對化肥施用的響應程度不同。β-葡萄糖苷酶屬于水解酶類，其主要功能是將大分子碳水化合物聚合物分解為小分子糖類[16]。紫云英還田條件下增加化肥施用量能夠增加土壤微生物生物量 (表1)，導致微生物需要更多的糖類完成新陳代謝活動，從而可能有利于相對β-葡萄糖苷酶效率的提高。過氧化物酶屬于氧化還原酶類，能夠參與木質素類物質的分解，為微生物提供碳源和養分[23,33]。增加配施化肥量能夠降低微生物對來自于木質素的養分的依賴，從而對過氧化物酶效率產生負反饋。另一方面，過氧化物酶效率受土壤環境中氧氣濃度的影響[23]，增加配施化肥量能夠增加微生物數量 (表1)，微生物代謝造成土壤環境中氧氣濃度降低，從而對酶效率產生抑制作用。然而，本研究也發現紫云英配施化肥對相對纖維素酶和相對酚氧化酶活性無顯著影響，其內在機理需要進一步研究。

土壤酶參與一系列的土壤生化過程，與土壤有機碳的轉化密切相關[23]。通徑分析發現，纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和蔗糖酶活性能夠直接影響土壤活性有機碳組分含量，而酚氧化酶和過氧化物酶則主要是間接作用，這可能與不同酶的不同功能有關。纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和蔗糖酶均為水解酶，能夠直接將外源輸入的有機物質或土壤有機質轉化為活性有機碳[16]。一方面，酚氧化酶和過氧化物酶能夠通過促進木質素的分解加快被木質素包裹的纖維素的釋放[34]，從而能夠為參與纖維素分解的酶提供充足的底物，進而促進了活性有機碳的形成。另一方面，酚氧化酶和過氧化物酶還能夠將土壤中的簡單芳香族化合物氧化成醌類，醌能夠與土壤中的蛋白質、糖類等物質反應生成復雜的有機物質[23]，從而能夠有效減少微生物對有機物質的利用，有利于活性有機質的保留。

4 結論

紫云英配施化肥能夠顯著增加土壤活性有機碳含量、土壤碳庫管理指數以及碳轉化酶活性，并且隨著配施化肥量的提高上述指標呈先增加后降低的趨勢，以配施60%常規化肥量效果最佳。紫云英還田條件下不同配施化肥量對土壤活性有機碳與總有機碳的比值無顯著影響。紫云英配施化肥能夠顯著增加相對蔗糖酶和相對β-葡萄糖苷酶活性，對相對纖維素酶和相對酚氧化酶活性無顯著影響。土壤活性有機碳含量受纖維素酶、蔗糖酶和β-葡萄糖苷酶活性的直接影響，而受酚氧化酶和過氧化物酶活性的間接影響。