超高效液相色譜-串聯質譜法測定香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯

王咪咪 謝德芳

摘? 要? 建立了香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯多殘留分析方法。樣品經1%乙酸乙腈提取，N-丙基乙二胺（PSA）和石墨化炭黑（GCB）凈化，以甲醇和2 mmol/L乙酸銨水溶液為流動相，進行梯度洗脫分離，采用電噴霧正離子源模式 （ESI+），多反應監測（MRM）采集數據，基質匹配外標法定量。吡蟲啉和高效氯氰菊酯在0.001～0.1 mg/L范圍內線性關系良好，相關系數r > 0.9991，方法檢出限（LOD）為1 pg，定量限（LOQ）為0.01 mg/kg。在0.01、0.05、0.10 mg/kg 3個添加水平下，吡蟲啉和高效氯氰菊酯在香蕉中的回收率為84.91%～104.78%，相對標準偏差（RSD）為1.23%～9.69%。該法操作簡單、靈敏度高、重現性好，適用于香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯的殘留量測定。

關鍵詞? 香蕉;吡蟲啉;高效氯氰菊酯;超高效液相色譜-串聯質譜中圖分類號? TQ453.6? ? ?文獻標識碼? A

Abstract? A method was established for the simultaneous determination of imidacloprid and β-cypermethrin residues in bananas. The samples were extracted with 1% of acetic acid-acetonitrile， cleaned by PSA and GCB. Gradient elution separation was carried out with methanol and 2 mmol/L ammonium acetate solution as the mobile phase. The samples were determined using electrospray positive ionization （ESI+） with multiple reaction monitoring （MRM） and then quantified by the matrix-matched external standard method. The results showed that the correlation coefficient r was > 0.9991， when the concentration ranged from 0.001 to 0.1 mg/L. The limit of detection （LOD） was 1 pg and the limit of quantification （LOQ） was 0.01 mg/kg. The recovery of imidacloprid and β-cypermethrin in banana was from 84.91% to 104.78% and the relative standard deviation （RSD） was from 1.23% to 9.69%. The method is simple， sensitive and reproducible for the determination of imidacloprid and β-cypermethrin residues in bananas.

Keywords? banana; imidacloprid; β-cypermethrin; UPLC-MS/MS

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.04.020

吡蟲啉（imidacloprid）屬新煙堿類內吸性殺蟲劑，具有高效、廣譜、低毒等優點，對蚜蟲、薊馬等害蟲有特效[1-2]。高效氯氰菊酯? 是擬除蟲菊酯類高效殺蟲劑中的一種，具有極高的胃毒和觸殺作用[3-4]。由于這2種農藥殺蟲效果顯著，近年來被廣泛應用于香蕉種植中。但在當前農業生產中，由于管理水平不一、監管不足，蕉農質量安全意識淡薄，擅自增加施藥次數和加大施藥劑量，導致農藥殘留風險增加。為了保證香蕉質量安全，建立快速準確測定香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯殘留的方法顯得尤為重要。

目前，已報道的吡蟲啉和高效氯氰菊酯的檢測方法主要有氣相色譜法[5-6]、高效液相色譜法[7]、高效液相色譜-串聯質譜[8]、氣相色譜-串聯質譜[9]等，涉及的基質有西紅柿、韭菜、水、蝦等。但是這些研究均為單一農藥的測定方法，同時測定香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯的分析方法尚未見報道。超高效液相色譜-串聯質譜（UPLC- MS/MS）檢測技術具有靈敏度高、檢出限低、抗干擾能力強和定性定量準確等特點，使其成為香蕉中農藥殘留檢測的常用技術。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）前處理方法因具有快速、簡單、價廉、有效、實用、安全等優點，在農產品農藥殘留檢測中得到廣泛應用。本研究采用改進的QuEChERS前處理技術，結合UPLC-MS/MS法建立了香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯同時測定的方法，以期為香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯的殘留檢測提供技術參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 香蕉，采自海口市澄邁縣香蕉園，采收時7～8分熟。

標準品吡蟲啉（純度為99.8%，德國Dr. Ehrenstorfer）、高效氯氰菊酯（純度為99.1%，美國Cato Research Chemical Inc.）;甲醇、乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）;甲酸、乙酸、乙酸銨、氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純AR，廣州化學試劑廠）;N-丙基乙二胺（PSA，深圳逗點生物技術有限公司）、石墨化炭黑（GCB，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.1.2? 儀器與設備? AB 4000+超高效液相色譜-串聯質譜，美國AB SCIEX公司;電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司;多管渦旋混合器，北京優晟聯合科技有限公司;超純水儀，成都超純科技有限公司;IKAT25高速勻漿機，上海萬捷科技有限公司;落地式高速冷凍離心機，日本Hitachi Koki Co.， Ltd;氮吹儀，美國Organomation Associates Inc.。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品前處理? 準確稱取10.0 g均質良好的香蕉樣品于50 mL離心管中，加20 mL 1%乙酸乙腈，以12 000 r/min勻漿2 min，2500 r/min渦旋5 min，8000 r/min離心5 min;將全部上清液轉入已加有2.0 g氯化鈉的50 mL離心管中，2500 r/min渦旋5 min，8000 r/min離心5 min;取10 mL上清液轉入已加有PSA（200 mg）+GCB（100 mg）+無水硫酸鎂（800 mg）的15 mL離心管中，2500 r/min渦旋5 min，8000 r/min離心5 min，取1.5 mL上清液過0.22 ?m有機系濾膜后收集于自動進樣瓶中，待進樣。

1.2.2? 檢測條件? （1）超高效液相色譜條件。色譜柱：Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m，Waters公司）;柱溫：40 ℃;流動相：A為2 mmol/L乙酸銨，B為甲醇;流速：0.25 mL/min;進樣量：10 ?L;運行時間：5 min。梯度洗脫程序：0～0.1 min，90%～40% A;0.1～ 1.5 min，40%～20% A;1.5～1.6 min，20%～10% A;1.6～4.0 min，10% A;4.0～4.1 min，10%～90% A;4.1～5.0 min，90% A。

（2）質譜條件。離子源：電噴霧正離子電離源（ESI+）;掃描方式：多重反應監測（MRM）;離子源溫度：600 ℃;碰撞氣：6 psi;霧化器GS1：50 psi、GS2：50 psi;離子噴霧電壓：5500 V;氣簾氣：20 psi。

2? 結果與分析

2.1? 檢測條件優化

2.1.1? 質譜條件優化? 將1.00 ?g/mL的化合物標準溶液，通過質譜儀注射泵以10 ?L/min的速度將其注入質譜系統，在正離子模式下進行母離子Q1 MS（Q1）掃描，確定分子離子峰，并對去簇電壓（DP）進行優化;以分子離子峰為母離子，進行子離子Product Ion（MS2）掃描，通過逐漸加大碰撞能量，使離子不斷破碎，當母離子峰高為子離子峰高的1/4～1/3時，停止增加碰撞能量。選擇離子峰度最強的為定量離子，選擇1～2個離子峰度較強的為定性離子，并對碰撞能量（CE）進行優化[10]。吡蟲啉和高效氯氰菊酯的質譜條件見表1。

2.1.2? 色譜條件優化? 采用Acquity UPLC BEH C18 色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 ?m），在流速為0.25 mL/min條件下，考察了乙腈-水、乙腈- 2 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-水、甲醇-2 mmol/L乙酸銨水溶液4種流動相體系對吡蟲啉和高效氯氰菊酯檢測結果的影響。結果表明，以甲醇- 2 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相時，目標化合物離子化效率高、峰形良好、靈敏度高。在此檢測條件下，吡蟲啉的保留時間為0.96 min，高效氯氰菊酯的保留時間為2.90 min。

2.2? 樣品前處理

2.2.1? 提取溶劑的選擇? QuEChERS方法通常以乙腈為提取劑對樣品中的化合物進行提取[11-12]。據文獻報道，乙腈中加酸不但有利于改善峰形、提高靈敏度，而且還可以提高農藥回收率[13-15]{！！！ INVALID CITATION ！！！ {李菊穎`， 2017 `#81`;李俊芳`， 2016 `#84}，? #0;李俊芳， 2016 #84;蘇敏， 2011 #82}。本研究比較了乙腈、0.1%甲酸乙腈、1%甲酸乙腈、0.1%乙酸乙腈、1%乙酸乙腈對香蕉全蕉和蕉肉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯的提取效果（表2）。研究結果表明，以乙腈、0.1%甲酸乙腈為提取劑時，吡蟲啉回收率較低，1%乙酸乙腈為提取劑時，吡蟲啉和高效氯氰菊酯的回收率較好，因而最終選擇1%乙酸乙腈作為提取劑。

2.2.2? 凈化劑的選擇? QuEChERS方法中常用的凈化劑有PSA、C18、GCB等[16-17]，其中PSA主要用于去除樣品中的糖類、有機酸、金屬離子等，C18用于去除樣品中的脂類和蛋白質等成分，GCB對樣品中色素有較強的吸附凈化能力[18-19]。分別以香蕉全蕉和蕉肉為基質，對凈化過程中不同凈化劑用量進行優化（表3）。結果表明，當PSA用量為200 mg時，2種農藥的回收率在93.09%～ 98.15%;隨著GCB用量的增加，提取液凈化效果逐漸提高，顏色逐漸變淺。當GCB用量為100 mg時，吡蟲啉和高效氯氰菊酯的回收率在93.83%～ 99.62%。同時加入一定量無水硫酸鎂，用于去除提取液中殘留的少量水分。最終確定的凈化劑組合為PSA（200 mg）+GCB（100 mg）+無水硫酸鎂（800 mg）。

2.3? 方法的線性相關性、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

采用外標法定量。將配制好的100 ?g/mL的吡蟲啉和高效氯氰菊酯標準貯備液，用甲醇逐級稀釋制成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1 ?g/mL標準溶液。取適量濃度一定體積的標準溶液，加入2 mL容量瓶中，氮氣吹干，按照1.2.1中所述方法，對空白香蕉全蕉和果蕉肉樣品進行處理，制得空白基質溶液。用空白樣品基質稀釋成0.001、0.01、0.02、0.05、0.1 ?g/mL標準溶液，過0.22 ?m有機膜，進樣。以峰面積對進樣濃度制作標準曲線（表4），結果表明，吡蟲啉和高效氯氰菊酯的溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線在0.001～ 0.1 ?g/mL質量濃度范圍內線性關系良好（r > 0.9991）。

2.4? 方法的精密度和加標回收率

稱取空白樣品加入一定量吡蟲啉、高效氯氰菊酯混合標準溶液，每個添加濃度重復5次。按照1.2節所述方法進行實驗，采用基質匹配標準曲線進行定量。吡蟲啉和高效氯氰菊酯在全蕉和蕉肉中的回收率為84.91%～104.78%;相對標準偏差（RSD）為1.23%～9.69%（表5）。該方法的準確度和精密度符合農藥殘留分析要求。

3? 討論

基質效應即樣品中其他組分對目標化合物測定結果的影響，是UPLC-MS/MS檢測過程中影響方法精密度、準確度和靈敏度的主要原因[20]。本研究中，采用基質匹配標準溶液制作曲線對樣品中的農藥殘留進行定量，最大限度的減少了基質效應對實驗結果帶來的影響。

QuEChERS是目前果蔬農藥殘留分析中最常用的前處理方法，其原理是利用凈化劑與樣品中雜質間的相互作用，吸附雜質而達到凈化的目的。其主要操作步驟為：樣品經乙腈提取，氯化鈉和無水硫酸鎂鹽析分層，PSA吸附凈化，過膜得待測液。本研究基于香蕉全蕉和蕉肉基質對QuEChERS方法進行優化：首先，在提取劑中加入少量酸性溶液，結果表明農藥的回收率顯著提高。李俊芳等[14]運用該法測定蘋果中農藥殘留時，發現1%乙酸乙腈為提取劑，農藥的回收率和相對標準偏差均優于原創方法（乙腈為提取劑）。主要是因為1%乙酸乙腈與加入的醋酸鹽形成醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，使得提取液pH控制在5左右，有利于農藥的提取。其次，對凈化劑進行選擇，并對其用量進行優化。凈化時加入一定量PSA和GCB，能有效去除樣品中糖類、有機酸、色素等成分，干擾物質的去除有利于降低方法檢出限，提高試驗結果準確度。

本研究建立了一種利用改進的QuEChERS為前處理方法，樣品經1%乙酸乙腈提取，PSA和GCB混合吸附劑凈化，結合UPLC-MS/MS對香蕉全蕉和蕉肉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯同時進行定性定量分析。采用基質匹配標準曲線進行定量，在0.001～0.1 ?g/mL范圍內，吡蟲啉和高效氯氰菊酯線性關系良好，相關系數r > 0.9991。方法平均回收率為84.91%～104.78%，RSD為1.23%～9.69%;檢出限為1 pg，定量限為0.01 mg/kg。該法前處理操作簡單、溶劑用量少，方法的精密度、準確度和靈敏度均符合殘留試驗要求，為香蕉中吡蟲啉和高效氯氰菊酯殘留分析研究提供參考。

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