超高效液相色譜法測定啶酰菌胺和咯菌腈在番茄與土壤中的殘留

馮玉潔 潘飛 謝圣華 梁延坡 馮青

摘? 要? 應用超高效液相色譜儀建立一種同時檢測番茄和土壤中啶酰菌胺和咯菌腈殘留的分析方法。樣品經乙腈提取，乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）吸附凈化，以乙腈和水為流動相等度洗脫，采用可變波長紫外檢測器檢測，外標法定量分析。結果表明，啶酰菌胺和咯菌腈在0.05～1 μg/mL范圍內呈現良好的線性關系，相關系數R2均為0.999，方法的檢出限均為0.01 mg/kg，定量限為0.1 mg/kg;在0.1～1 mg/kg范圍內，添加回收率在82.8%～102.8%和86.5%～115.3%之間，相對標準偏差（RSD）在4.1%～8.7%和4.9%～9.1%之間。該方法簡單可靠、重現性好，適用于番茄和土壤中啶酰菌胺和咯菌腈的殘留檢測。

關鍵詞? 番茄;土壤;啶酰菌胺;咯菌腈;超高效液相色譜;殘留

中圖分類號? S481.8? ? ? 文獻標識碼? A

啶酰菌胺是一種新型煙酰胺類內吸性殺菌劑，屬呼吸作用抑制劑，對灰葡萄孢分子孢子萌發和真菌菌絲生長均有較強的抑制作用，對番茄灰霉病和菌核病、白粉病等具有較好的防治效果[1]。咯菌腈是苯基吡咯類非內吸性殺菌劑，為酶抑制劑，通過抑制分裂蛋白活化激酶/組氨酸激酶活性，影響分生孢子萌發、細菌芽管伸長及菌絲生長等，對番茄灰霉病有良好的防治效果，且不易與腐霉利、多菌靈等殺菌劑間存在交互抗藥性[2-3]。啶酰菌胺和咯菌腈目前正廣泛應用于防治蔬菜、水果的灰霉病、莖腐病和菌核病，隨著其大量使用所引發的農藥殘留問題不容忽視。

目前，啶酰菌胺的定性定量檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質譜法、液相色譜法及液相色譜-質譜法。2011年，張玉婷等[4]采用氣相色譜儀-電子捕獲檢測器（GC-ECD）分析了葡萄和土壤中啶酰菌胺的殘留動態;2015年，楊莉莉等[5]采用氣質聯用儀（GC-MS）研究了啶酰菌胺在草莓和土壤中的殘留量及消解動態，方法的定量限（LOQ）分別為0.05和0.1 mg/kg;2012年，鄭尊濤等[6]采用GC-MS法研究啶酰菌胺在草莓和土壤中的殘留量及消解動態，所采用的方法最低檢出限（LOD）為0.3 ng/kg，在番茄和土壤中的定量限為0.01 mg/kg;湯永嬌等[7]采用超高效液相色譜法（HPLC）分析了芒果中啶酰菌胺的殘留，方法檢出限為0.002 mg/kg;2012年郭慶龍等[8]采用液質聯用儀（LC-MS/MS）分析了蔬果中啶酰菌胺的殘留，方法檢出限和定量限分別為0.295 μg/kg和1.32 μg/kg。咯菌腈主要使用HPLC法和GC法進行分析。2012年占繡萍等[9]采用HPLC測定蔬菜中咯菌腈等農藥的殘留量，儀器最小檢出量為1 ng，最低檢測濃度為0.1 mg/kg;2015年張文[10]采用氣相色譜儀-氮磷檢測器（GC-NPD）檢測了咯菌腈在葡萄和土壤中的殘留量及消解動態，方法最低檢出量為0.13 ng，在葡萄和土壤中的最低檢出質量濃度均為0.1 mg/kg。

但目前關于同時測定啶酰菌胺和咯菌腈在番茄及土壤中殘留的方法尚未見報道。本研究利用分散固相萃取凈化結合超高效液相色譜（UPLC），建立了番茄與土壤中啶酰菌胺和咯菌腈的快速檢測方法，可用于番茄和土壤中啶酰菌胺和咯菌腈的殘留檢測。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 番茄對照樣品采自海南省農業科學院澄邁永發基地，生長過程未使用任何農藥，檢測實際番茄樣品購自海口當地農貿市場，切塊制成糜樣于18 ℃冰箱中冷凍保存，備用。

啶酰菌胺標準品（99.0%）、咯菌腈標準品（99.0%），德國Dr. Ehrenstorfer公司;乙腈（色譜純），美國Thermo Fisher公司;乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、C18吸附劑，美國Varian公司;無水硫酸鎂（農殘級）、氯化鈉，國藥集團。無水硫酸鎂使用前于400 ℃烘干備用。

1.1.2? 儀器與設備? Agilent 1290超高效液相色譜儀，美國Agilent公司;高速冷凍離心機，美國Thermo公司;渦旋混勻器，海門市其林貝爾儀器有限公司;Milli-Q超純水儀，德國Millipore公司;0.22 μm微孔濾膜，上海安譜科學儀器有限公司;AUY220型電子分析天平，日本島津公司。

1.2? 方法

1.2.1? 標準溶液配制? 稱取適量啶酰菌胺和咯菌腈標準品用乙腈溶解配置成1000 μg/mL母液，移取適量母液至容量瓶，用乙腈稀釋成質量濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1 μg/mL系列混合標準溶液，混勻后放入4 ℃冰箱保存備用。

1.2.2? 前處理方法? 稱取番茄和土壤樣品各10.0 g（精確至0.01 g），分別置于50.0 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈和5.0 g氯化鈉，劇烈震蕩2.0 min，加入6.0 g無水硫酸鎂，經渦旋混勻器提取2.0 min后，4000 r/min離心5.0 min，準確吸取上清液5.0 mL到裝有200 mg PSA、500 mg無水硫酸鎂的離心管中，渦旋2.0 min后，5000 r/min離心3.0 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，進UPLC分析。

1.2.3? 色譜條件? 色譜柱為ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃，流動相為乙腈∶水=50∶50（V/V），流速0.20 mL/min，可變波長紫外檢測器，檢測波長260 nm，進樣量2.0 μL。

2? 結果與分析

2.1? 檢測波長的確定和標準曲線

通過紫外光譜檢測，啶酰菌胺和咯菌腈的最大吸收波長分別是205 nm和268 nm，但考慮到低波段對目標峰有干擾和兩種農藥吸收波長的選擇，選擇260 nm為實際檢測波長。

在質量濃度為0.05～1 μg/mL范圍內，以峰面積（y）為縱坐標，進樣濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，外標法定量。2種農藥的質量濃度和峰面積間呈線性關系，啶酰菌胺和咯菌腈的保留時間分別為2.977、3.675 min，2種農藥的UPLC譜圖見圖1。以3倍信噪比作為方法檢出限（LOD），以最小添加濃度作為方法的定量限（LOQ），結果見表1。

2.2? 樣品前處理條件的優化

通過比較2種組合（組合1：PSA 200 mg;組合2：PSA 200 mg與C18 25 mg）凈化效果，結果表明，PSA可有效去除番茄中有機酸、色素和

糖類等雜質，凈化效果良好，且對檢測無干擾，添加C18后對凈化效果沒有太大改善，故本研究采用PSA作為凈化劑進行分散固相萃取。在加標濃度為0.5 mg/kg的5 mL乙腈提取液中分別加入0.05、0.10、0.15、0.20、0.30 g 的PSA，考察PSA用量對凈化效果的影響。結果表明，加入0.2g PSA時，溶液無色透明，凈化效果良好，對目標物測定無干擾，回收率為94.2%，符合農藥殘留檢測要求。

2.3? 回收率、精密度與檢出限

在空白的番茄和土壤樣品中分別按照0.1、0.5、1 mg/kg 3個水平添加啶酰菌胺和咯菌腈，每個添加水平重復5次。添加回收實驗結果表明，在0.1～1 mg/L 3個添加水平下，番茄中，啶酰菌胺平均回收率在88.2%～102.8%，相對標準偏差（RSD）為4.5%～8.7%;咯菌腈平均回收率在90.2%～93.1%，RSD為4.9%～6.6%（表2）。土壤中，啶酰菌胺平均回收率在82.8%～85.5%，RSD為4.1%～8.1%;咯菌腈平均回收率在86.5%～ 115.3%，RSD為7.1%～9.1%。番茄和土壤中啶酰菌胺的定量限（LOQ）均為0.1 mg/kg，咯菌腈的LOQ均為0.1 mg/kg。

2.4? 實際樣品的檢測

本研究隨機抽取了市售7份番茄樣品和5份土壤樣品進行檢測，啶酰菌胺和咯菌腈殘留量均低于檢出限。

3? 討論

基于安全考慮，很多國家均規定了啶酰菌胺和咯菌腈在各類食品中最高殘留限量，國際食品法典委員會（Codex Alimentarius Commission，CAC）、歐盟（European Union，EU）和日本限量值在0.02～40 mg/kg和0.01～50 mg/kg之間[11-13]，日本規定了啶酰菌胺和咯菌腈在番茄上MRL值分別為5 mg/kg和2 mg/kg，CAC規定了咯菌腈在番茄上的最大殘留限量值（MRL）為0.5 mg/kg。我國于2016年12月發布的新版《國家食品安全標準 食品中農藥最大殘留限量》[14]（GB 2763-2016）中規定了啶酰菌胺在蘋果、黃瓜、甜瓜、草莓、葡萄等食品中5項殘留限量，限量值為2～5 mg/kg;咯菌腈在棉籽的殘留限量值，限量值為0.05 mg/kg，二者在番茄中的殘留限量仍在制定中。現行的檢測食品中啶酰菌胺和咯菌腈的國家標準只有3個，即GB 23200.68-2016[15]、GB/T 20769-2008[16] 和GB 23200.8-2016[17]，而國標GB 23200.68-2016、GB/T 20769-2008僅制定了食品中啶酰菌胺的檢測方法且定量限均為0.01 mg/kg，國標GB 23200.8-2016中制定了水果和蔬菜中咯菌腈的檢測方法其定量限為0.06 mg/kg，但不能同時檢測啶酰菌胺含量。國標GB 23200.68-2016采用液/液分配和固相萃取（SPE）兩次凈化，GB/T 20769-2008和GB 23200.8-2016采用SPE凈化，并用大量溶劑洗脫，每個樣品凈化時間達到30～40 min，消耗相當長時間和大量溶劑，并對檢測人員健康造成潛在危害。

超高效液相色譜法（UPLC）的技術核心是在非常高的壓力下（其柱壓最高可達到18 000 psi），通過降低固定相的粒度，提高流動相線速度的方法，對復雜樣品進行高效、快速地分離和分析，其分離度、靈敏度和分析速度相比傳統的高效液相色譜（HPLC）分別提高了1.7倍、3倍和9倍[18]。傳統HPLC在進行多組分分析時，需消耗相當長時間和大量溶劑，而利用UPLC技術可以在很大程度上縮短分析時間，提高效率，并減少溶劑的使用量，降低分析成本。

本研究通過優化QuEChERS前處理方法的分散固相萃取技術，建立了番茄和土壤中啶酰菌胺和咯菌腈殘留的超高效液相色譜檢測方法。優化實驗表明以PSA為吸附劑對番茄和土壤樣品提取液進行凈化效果最好。添加回收試驗的平均回收率在82.8%～115.3%之間，RSD小于9.1%。該方法對啶酰菌胺和咯菌腈的檢出限均為0.01 mg/kg。本方法具有操作簡單、節省溶劑用量、分析速度快等特點，能夠滿足番茄和土壤中啶酰菌胺和咯菌腈的殘留分析的要求。

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