南方紅壤丘陵區土壤細菌對土壤水分和溫度的響應差異

楊杰 陳聞 侯海軍 陳春蘭 秦紅靈 呂殿青

摘? 要? 紅壤丘陵區稻田不同時期進行的水分管理導致土壤水分和溫度同時變化，繼而影響土壤微生物群落結構，二者對土壤微生物的影響機制目前還不清楚。本研究以中國科學院桃源農業生態實驗站長期定位試驗的稻田作為研究對象，同時以旱地農田作為對照，利用末端限制性酶切片段長度多態性分析（T-RFLP）和熒光定量PCR（qPCR）方法，研究不同水分管理時期細菌群落結構與豐度的變化特征，進而分析其變化的影響因素，闡明水分和溫度的相對貢獻。結果表明，稻田土壤細菌受土壤水分狀況的顯著影響，淹水期土壤細菌群落結構明顯區別于其他時期，且淹水期土壤細菌豐度和多樣性指數均顯著低于曬田期。稻田土壤細菌群落結構和多樣性指數均受到土壤含水量和土壤溫度的顯著影響，但土壤含水量的相關性大于土壤溫度。而作為對照的旱地農田土壤含水量在不同時期沒有差異，土壤細菌群落結構也沒有差異，僅土壤細菌豐度和多樣性指數發生一定變化，但這種變化并不與土壤溫度呈現相關性。因此，本研究認為，南方丘陵區農田土壤細菌對土壤水分的響應比對土壤溫度更敏感。

關鍵詞? 稻田;旱地;細菌群落結構;細菌豐度;土壤水分;土壤溫度

中圖分類號? X171.3? ? ?文獻標識碼? A

紅壤是我國重要的土壤資源，主要分布于長江以南的低山丘陵區，涉及諸多省區，其農業產值負擔了全國近一半的人口[1]，是中國糧食和亞熱帶經濟作物及果、林、草發展的重要基地[2]。但是南方丘陵區雨水較多，是中國水土流失最為嚴重的區域之一[1]，從而導致水土退化范圍廣、程度高，生態環境遭到嚴重破壞[3]。土壤微生物是生態系統的重要組成部分，是土壤碳、氮、磷等元素生物地球化學循環的主要推動力，在維持土壤生態系統的穩定性與功能方面起著關鍵作用[4-6]。

稻田是亞熱帶紅壤區最主要的農田利用方式，當地農民廣泛應用間歇灌溉的水分管理方式來增加水稻有效分蘗和水稻植株的光合效率，提高根系活力和根系對土壤養分的利用效率[7]。不同水分管理方式通過改變土壤相關物理化學性質，包括土壤水分、通氣狀況、Eh等，進而影響微生物種群[8-9]。例如張敬智等[10]研究發現，淹水稻田土壤微生物群落結構顯著不同于好氣條件下的稻田土壤。在農田生態系統中，土壤微生物的群落結構與數量可以作為衡量土壤肥力高低和土壤可持續生產力的重要指標。目前大部分的研究主要是依托野外定位試驗或室內模擬試驗，采集相同時間點不同水分處理土壤研究水分管理對土壤微生物群落結構的影響[11-12]。但在實際農業生產中，稻田間歇灌溉發生在不同時期，稻田土壤水分和溫度同步發生變化。而土壤溫度也是影響微生物群落結構的重要因素[13-14]。目前，不同水分管理措施下水分和溫度對土壤微生物變化的影響機制還不清楚。而與稻田相比，亞熱帶紅壤區旱地農田往往無人工灌溉，土壤水分含量保持穩定，而土壤溫度隨季節而變化，為研究土壤微生物對水分和溫度的響應方式提供了良好的土壤對照條件。

本研究采用T-RFLP和qPCR技術相結合的方法，以紅壤丘陵區近30年一直種植雙季稻的稻田土壤為對象，研究了不同采樣時期土壤細菌豐度和群落結構的變化特征及其影響因素，同時以開墾年代相似、玉米-油菜輪作的旱作農田為對照，測定同時期的細菌豐度和群落結構特征。對比分析了土壤細菌群落對土壤水分和溫度的敏感性，以期闡明不同水分管理措施下紅壤稻田土壤細菌豐度和群落結構變化的驅動機制，為認識不同管理條件下稻田土壤微生物的特征及制定農田合理的水分管理措施等提供基礎數據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試土壤? 土壤樣品采自中國科學院桃源農業生態試驗站。該試驗場地處湖南省桃源縣漳江鎮寶洞峪村 （111°26'E，28°55'N），氣候屬于中亞熱帶向北亞熱帶過渡的季風濕潤氣候，年均氣溫16.5 ℃，年均降水量為1447.9 mm，年日照時數1530 h，土壤類型為第四紀紅土黏土發育的紅壤，稻田以種植雙季稻為主，旱地主要種植玉米、油菜等。

1.1.2? 儀器與設備? ?流動注射儀，型號AA3，德國SEAL公司;有機碳分析儀，型號Vwp，日本島津公司;熒光定量PCR儀，型號ABI 7900 HT，美國AB公司。

1.2? 方法

1.2.1? 試驗設計? 在桃源農業生態試驗站長期定位試驗田中，選擇雙季稻和玉米-油菜輪作旱地兩種農田利用方式，分別設置3個獨立小區（8 m×5 m）作為重復樣地。雙季稻田全年施肥量為：N 182.3 kg/hm2， P 39.3 kg/hm2， K 197.2 kg/hm2;玉米-油菜輪作旱地施肥量為：N 240 kg/hm2， P 52.4 kg/hm2， K 286.4 kg/hm2。雙季稻田在水稻生育期進行淹水-烤田-淹水-干濕交替的水分管理模式，淹水保存田間水層5 cm，曬田排水后自然曬干2周;玉米-油菜輪作旱地沒有人工灌水。

1.2.2? 樣品采集? 2012年10月—2014年7月，在稻田淹水期（7月，夏季;F）、曬田期（10月，秋季;D）和冬春干旱期（1月和4月;W，S）采集稻田土壤樣品，同時間采集同時期旱地土壤樣品作為對照，不同年際樣品作為采樣重復。為了盡量減少施肥對土壤性狀的影響，樣品采集于施肥前或施肥2月后。2014年7月，稻田采樣時，旱地剛剛施肥一周，因此，本研究剔除了這次的旱地樣品。每個小區S形多點采集表層0～ 20 cm土壤后混勻，一部分土壤（100 g）迅速用液氮冰凍后80 ℃保存供分子生物學研究，另一部分土樣（400 g）4 ℃保存用于測定土壤銨態氮、硝態氮和土壤可溶性有機碳（DOC）等相關理化性質。2012年采樣開始時，土壤基本理化性狀見表1。

1.2.3? 數據收集? 土壤理化性質測定：采樣當天，利用地溫計測定5 cm土層土壤溫度;土壤含水量使用烘干法;土壤銨態氮和硝態氮用1 mol/L的KCl溶液浸出的土壤懸浮液，過濾后使用流動注射系統進行分析;土壤可溶性有機碳（DOC）利用0.5 mol/L的K2SO4浸提，過濾后用有機碳分析儀測定。稻田土壤硝態氮含量低于檢測線，不進行后續分析。

微生物豐度及群落結構的測定：DNA的提取參照楊建等[15]的SDS-GITCPEG方法。熒光定量PCR采用采用16S通用引物1369F/1492R在熒光定量PCR 儀上進行自動化PCR 反應定量擴增細菌16S rDNA，引物信息及PCR反應條件同秦紅靈等[4]。標準曲線的建立參照Chen等[16]的方法。T-RFLP試驗采用16S通用引物27F/1492R擴增細菌16S rDNA，其中上游引物5'端用6-羧基二乙酸熒光素（FAM）標記，用于T-RFLP試驗[4]。末端熒光標記的PCR純化后產物用 MspⅠ消化，酶切產物的T-RFLP分析由上海桑尼生物技術有限公司完成。

1.3? 數據處理

所有測定結果均為3次重復的平均值，誤差線為標準差（SD）。使用SPSS 10.0軟件單因素方差分析（One-Way ANOVA）和多重比較分析（LSD）不同采樣時期土壤理化性質以及細菌豐度和多樣性的差異，Pearson相關分析土壤理化性質與土壤細菌豐度和多樣性指數的關系。利用Canoco v. 4.5軟件主成分分析（PCA）不同采樣時期土壤細菌群落結構的相似性，蒙特卡洛檢驗土壤理化性質對細菌群落結構的影響。

2? 結果與分析

2.1? 紅壤稻田和旱地土壤理化性狀

方差分析結果表明，稻田土壤含水量、土壤溫度、銨態氮和DOC含量均受采樣時期的影響。稻田夏季淹水期土壤含水量、土壤溫度和銨態氮含量顯著高于其他3個時期，但DOC含量顯著低于其他時期;而旱地無人為灌溉，不同采樣時期土壤含水量沒有差異，但土壤溫度呈現了和稻田相同的變化規律，另外土壤硝態氮、銨態氮和DOC含量不同采樣時期也存在顯著差異，冬季土壤銨態氮和土壤DOC最高，秋季土壤硝態氮含量最高（表2）。

2.2? 紅壤稻田和旱地土壤細菌群落結構

根據T-RFLP 圖譜分析發現，稻田土壤細菌群落結構受采樣時期的顯著影響，夏季淹水期土壤細菌分布明顯與其他3個時期不同。淹水期相對豐度排在前3位的bp片段分別是：150、148和436 bp t-RFs，其中，150 bp t-RF在淹水期相對豐度最高為30.79%，比其他3個采樣時期高出10%以上;436 bp t-RF淹水期相對豐度為9.53%，是其他3個時期的2倍左右（圖1A）。利用網絡在線服務（http：//trflp.limnology.wisc.edu/index. jsp）PAT工具（The T-RFLP Phylogenetic Assignment Tool）可以得到，150 bp與甲烷氧化菌（AF150788）末端片段一致，436 bp與海洋雪相關細菌（AF030780）末端片段一致。主成分分析（PCA）也表明，稻田淹水期土壤細菌在PC1軸與其他3個采樣時期明顯分離（圖1C）。而旱地土壤細菌群落結構不受采樣時期的影響，土壤細菌群落交錯分布，沒有明顯的聚類（圖1B，圖1D）。

2.3? 紅壤稻田和旱地土壤細菌豐度和多樣性指數

方差分析結果表明，稻田土壤細菌豐度和多樣性指數均受到采樣時期的影響，夏季淹水期土壤豐度和多樣性指數低于秋季曬田期，冬春旱季干旱期居中（圖2A，圖2C）。旱地土壤細菌豐度和多樣性指數也受到采樣時期的影響，但兩者的趨勢不一致，秋季土壤細菌豐度最低，多樣性指數春季較低（圖2B，圖2D）。

2.4? 土壤細菌群落結構、豐度及多樣性與土壤理化性質的關系

蒙特卡洛檢驗發現，稻田土壤細菌群落結構受土壤含水量、土壤溫度、銨態氮和DOC含量的

影響，而旱地土壤群落結構只受到土壤DOC含量的影響;與群落結構結果相一致，稻田土壤細菌多樣性指數受到土壤含水量、土壤溫度和銨態氮的影響，但細菌豐度與測定的土壤理化性質沒有顯著相關關系;旱地土壤細菌豐度和多樣性指數與測定的土壤理化性質均不存在顯著相關關系（表3）。

3? 討論

3.1? 土壤細菌群落結構對土壤水分的響應比溫度更敏感

間歇灌溉是亞熱帶紅壤區稻田水分管理的常見方式，而稻田水分管理方式對土壤微生物具有顯著的影響。本研究采集不同水分管理時期的稻田土壤樣品，研究稻田不同水分狀態對土壤細菌群落的影響發現，淹水期稻田土壤細菌群落結構明顯區別于其他3個采樣時期，且淹水期土壤細菌多樣性指數和豐度均小于曬田期。稻田淹水不僅造成土壤含水量的降低，同時還意味著土壤Eh

和氧氣濃度的降低，抑制了土壤中好氣微生物的生長[17]，同時促進了某些厭氧微生物的生長，如反硝化菌和產甲烷菌[18-19]，從而造成了細菌群落組成和多樣性的變化。同時，Sahrawat[20]和張薇等[21]研究發現，淹水條件不利于土壤有機碳的礦化，抑制了土壤的供碳能力，這一方面影響細菌的總體生長狀況，另一方面也會影響微生物的組成。例如張敬智等[10]研究發現，淹水稻田和好氣稻田由于有機碳組分的不同，微生物群落結構產生適應性變化。本研究中淹水期土壤細菌豐度和多樣性的減少，可能與特定功能微生物的富集有

表3? 土壤細菌豐度、多樣性指數及群落結構與土壤理化性質的關系

Tab. 3? Relationships between soil bacterial abundance， diversity， community structure and soil physicochemical properties

指標

Items 農田類型

Cropland type 相關性

Correlation 土壤含水量 Soil moisture 土壤溫度

Soil temperature 土壤銨態氮

Ammonium N 土壤硝態氮 Nitrate N DOC

細菌豐度 稻田 R 0.32 0.18 0.37 — 0.15

ρ 0.13 0.41 0.08 — 0.48

旱地 R 0.18 0.15 0.16 0.20 0.37

ρ 0.44 0.52 0.48 0.39 0.10

細菌多樣性指數 稻田 R 0.58 0.44 0.61 — 0.26

ρ 0.00* 0.03* 0.00* — 0.22

旱地 R 0.25 0.18 0.20 0.34 0.22

ρ 0.28 0.44 0.39 0.13 0.35

細菌群落結構 稻田 R 14.12 10.13 14.69 — 6.18

ρ 0.00* 0.00* 0.00* — 0.01*

旱地 R 0.88 0.69 0.60 1.54 3.43

ρ 0.42 0.65 0.68 0.14 0.02*

注：細菌豐度和多樣性與土壤性質的關系采用Pearson相關分析，細菌群落結構與土壤性質的關系采用蒙特卡洛檢驗;樣本數：稻田n=24;旱地n=21。*表示相關性達到5%的顯著水平。

Note： Pearson correlation analysis was used to analyze the relationship between soil bacterial abundance and soil properties， and Monte Carlo method was used to analyze the relationship between community structure and soil properties. Number of samples： paddy field n=24; dryland n=21. * indicated the correlation reached 5% significance level.

關，T-RFLP圖譜分析也確實發現了某些與土壤水分含量相關的功能微生物如甲烷氧化菌和海洋雪相關細菌在稻田富集。

溫度也是造成土壤微生物改變的重要因素，溫度和土壤微生物的關系已被很多研究者所證明[13， 22]。例如Fey等[23]通過室內設置不同溫度梯度，研究發現溫度對水稻土產甲烷古菌的群落結構、活性和功能均產生顯著影響。但是在本研究中，土壤溫度對土壤微生物的影響較小，例如稻田冬春干旱期，土壤含水量沒有差異，土壤溫度相差12.83 ℃，但是土壤細菌群落結構、豐度和多樣性指數均沒有顯著差異;旱地夏季和冬季采樣時期土壤水分含量沒有差異，溫度相差28.19 ℃，土壤細菌群落結構、豐度和多樣性指數也沒有顯著差異。土壤水分對微生物的影響強度高于溫度，在其他研究中也有發現，例如亞熱帶森林土壤海拔高度改變時，微生物群落功能多樣性產生差異的主要原因是土壤含水量，而非土壤溫度[24]。另外，土壤溫度與土壤微生物的相關性可能需要基于良好的水分環境，例如李世清等[25]的研究發現，當田間土壤含水量足夠維護微生物的活性，土壤溫度與土壤微生物量氮之間存在顯著的正相關關系。而在本研究中，旱地農田土壤水分含量穩定，且顯著低于稻田水分含量，因此土壤溫度與土壤微生物并沒有表現出顯著的相關性，而稻田中二者卻表現出了正相關關系。因此，本研究證實，在亞熱帶紅壤區，土壤水分而非土壤溫度是調控農田生態系統微生物群落結構的關鍵因子。

3.2? 稻田與旱地土壤群落結構的差異原因分析

稻田與旱地由于種植方式的不同，土壤微生物群落結構產生顯著差異。本研究發現旱地土壤中大于10%相對豐度的優勢菌群（148、140 bp t-RFs）不同于水田土壤（150 bp t-RF）。稻田和旱地農田土壤微生物的不同也被其他研究者證實。沈冰潔等[5]研究發現旱地土壤中α-變形菌和γ-變形菌的相對豐度較高，而稻田土壤中β-變形細菌和甲烷菌的相對豐度較高。李忠佩等[26]的研究也表明中國亞熱帶丘陵地區，稻田土壤微生物群落功能多樣性高于旱地土壤。亞熱帶紅壤區稻田土壤由于淹水、曬田等水分管理措施的存在，水分狀態頻繁發生變化，并且誘發了土壤通氣狀態、養分狀態等的改變，而土壤微生物對氧氣狀態[18]和礦質氮形態[27]等具有偏好性，因此造成了稻田和旱地農田土壤微生物的不同。例如稻田土壤水分含量更高，可能更有利于厭氧或兼性厭氧微生物的生存，例如反硝化微生物[18]的生存;而旱地土壤水分含量較低，可能更有利于好氣微生物的生存[17];稻田土壤礦質氮以銨態氮為主，可能更有利于喜銨微生物的生存，旱地以硝態氮為主，可能更有利于對硝態氮具有偏好性的微生物的生存。另外，土壤中功能微生物也會因為稻田和旱地農田土壤性質的不同而發生變化，例如銨態氮和硝態氮作為硝化作用和反硝化作用的底物，稻田和旱地土壤間的差異，勢必會引起硝化功能和反硝化功能微生物的差異。最終在這些因素的共同作用下，稻田和旱地土壤微生物產生了顯著分異。

4? 結論

南方紅壤區稻田生態系統土壤細菌群落結構、豐度和多樣性隨采樣時期土壤水分狀況的不同產生顯著差異，淹水期土壤某些功能微生物的富集，減少了土壤細菌豐度和多樣性。旱地不同采樣時期土壤含水量沒有差異，即使夏冬采樣時期土壤溫度相差超過25 ℃，土壤細菌群落結構、豐度和多樣性均沒有顯著差異。因此，本研究認為亞熱帶紅壤丘陵區農田土壤細菌對土壤水分的響應比對土壤溫度更敏感。

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