橡膠樹葉柄愈傷組織乳管細(xì)胞的組織化學(xué)和分子生物學(xué)研究

譚德冠 彭晶 韓冰瑩 付莉莉 孫雪飄 張家明

摘 ?要??橡膠樹乳管分化研究主要以樹皮為研究材料。本研究通過組織化學(xué)染色法、尼羅紅熒光染色法、免疫組織化學(xué)法和分子生物學(xué)方法證實(shí)橡膠樹葉柄來源的愈傷組織中存在乳管細(xì)胞。乳管細(xì)胞在葉柄愈傷組織中隨機(jī)分布，分布模式類似橡膠樹初生乳管;葉柄愈傷組織乳管細(xì)胞在發(fā)育早期時(shí)橡膠粒子較少，在發(fā)育后期時(shí)充滿橡膠粒子。RT-PCR擴(kuò)增出葉柄愈傷組織乳管細(xì)胞的橡膠延伸因子（REF）、小橡膠粒子蛋白（SRPP）、橡膠凝集素（hevein）和橡膠轉(zhuǎn)移酶（CPT）等膠乳特異基因的轉(zhuǎn)錄本，經(jīng)比對它們序列與所報(bào)道的橡膠樹樹干膠乳中表達(dá)的基因序列一致，表明橡膠樹葉柄愈傷組織乳管細(xì)胞擁有樹皮乳管細(xì)胞相似的功能，為葉柄愈傷組織作為一種新型的研究乳管分化的模式提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 ?橡膠樹;葉柄愈傷組織;乳管細(xì)胞;乳管分化;研究模式中圖分類號??Q949.748.5??????文獻(xiàn)標(biāo)識碼??A

Histochemical and Molecular Characterization of Laticifer Cells in Calli Derived from Petioles of Rubber Tree

TAN Deguan， PENG Jing， HAN Bingying， FU Lili， SUN Xuepiao， ZHANG Jiaming^*

Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Tropical Crop Biology and Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract ?The trunk bark of rubber tree （Hevea brasiliensis） is usually used as the material for the study of laticifer differentiation. In this study， we confirmed the presence of laticifer cells in petiole-derived calli by histochemical staining， nile red fluorescence staining， immunohistochemistry and molecular biology. Laticifer cells in petiole-derived calli were distributed randomly， similar to the primary laticifers. They contained less rubber particles in the early developmental stage， and were full of rubber particles in the late developmental stage. The laticifer-specific genes including REF， SRPP， Hevein and CPT were confirmed to be expressed from the petiole-derived callus by RT-PCR， and their transcripts were the same as those reported in the latex of the trunk barks. These results indicated that the laticifer cells in the petiole-derived calli and in barks had similar functions， which would provide a basis for petiole-derived callus as a novel research model to study laticifer differentiation in the rubber tree.

Keywords ?rubber tree （Hevea brasiliensis）; petiole-derived calli; laticifer cells; laticfer differentiation; research model

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2019.01.011

乳管是一種高度特化的細(xì)胞，是植物貯存和合成膠乳的場所。全球共有22個(gè)屬12?500種植物含有乳管細(xì)胞，但只有橡膠樹來源的膠乳才具有商業(yè)開發(fā)價(jià)值^[1]。橡膠樹是一種重要的熱帶經(jīng)濟(jì)林木，由于其膠乳具有產(chǎn)量高、易收集等優(yōu)勢，占全球天然橡膠的產(chǎn)量99%^[2]。乳管細(xì)胞的數(shù)量與橡膠樹的產(chǎn)量正相關(guān)^[3]，因此研究如何促進(jìn)乳管細(xì)胞分化從而提高橡膠樹的產(chǎn)量是橡膠樹科研人員的重要課題。目前橡膠樹乳管分化的研究主要以樹皮為研究模式，但樹皮模式易受大田環(huán)境（溫度、光照、土壤等）的影響，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差;且從種植至開割需7年之久，研究周期長。這些客觀原因?qū)е氯楣芊只难芯窟M(jìn)展緩慢。

Tan等^[4-5]發(fā)現(xiàn)來源于花藥的愈傷組織存在乳管細(xì)胞，并提出了花藥愈傷組織可作為一種研究乳管分化的新模式。花藥愈傷組織模式具有環(huán)境條件可控制、實(shí)驗(yàn)周期短、重復(fù)性好的優(yōu)勢，可克服樹皮乳管模式的缺點(diǎn)。但由于橡膠樹一年只有3次花期（春花、夏花、秋花），且每次雄花花期為15?d左右^[6]，導(dǎo)致采用花藥愈傷組織模式研究乳管分化受采樣時(shí)間的限制。橡膠樹的枝條頂端被剪后，10?d左右新的幼嫩枝條就會從其腋芽中抽出。因此采用橡膠樹幼嫩的葉柄作為外植體來誘導(dǎo)愈傷組織不受采樣時(shí)間的限制。然而目前尚不清楚葉柄來源的愈傷組織中是否也存在乳管細(xì)胞。本研究通過組織化學(xué)法、尼羅紅熒光染色法、免疫組織化學(xué)法和分子生物學(xué)法驗(yàn)證葉柄愈傷組織中是否存在乳管細(xì)胞，為葉柄愈傷組織能否作為研究乳管分化的新模式提供科學(xué)依據(jù)。

1??材料與方法

1.1材料

采用橡膠樹品種熱研7-33-97盆栽芽接苗，種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所溫室。去除枝條頂端，10 d后采集從腋芽中新抽出的處于古銅期枝條的葉柄作為外植體。

1.2方法

1.2.1??葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)??將幼嫩的葉柄剪成3?cm長，于超凈工作臺中70%酒精消毒1?min，0.15%升汞消毒10?min，無菌水清洗5遍。將消毒好葉柄切成1?cm小段，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，附加2，4-D 2 mg/L、 NAA 0.5?mg/L、6-BA 1 mg/L、蔗糖80 g/L和植物凝膠2.5?g/L，pH調(diào)整至6.0。在黑暗條件下25?℃培養(yǎng)80?d。

1.2.2 ?組織化學(xué)染色法??組織化學(xué)染色法參照田維敏等^[7]介紹的方法進(jìn)行。分別將10齡的熱研7-33-97樹干樹皮、枝條樹皮和培養(yǎng)80?d的葉柄愈傷組織塊室溫條件下于80%酒精固定2?d，將固定好的材料經(jīng)酒精系列脫水，冰醋酸過渡4?h，60?℃下溴-碘溶液（冰醋酸100?mL，碘5?g，溴液0.4 mL）處理42?h。溴-碘溶液處理后的材料經(jīng)正丁醇透明，石蠟包埋與切片，切片厚度10??m片。經(jīng)二甲苯浸泡切片2次，后用固綠溶液（1 g固綠溶于100 mL 95%酒精）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察切片。

1.2.3 ?尼羅紅熒光染色法??尼羅紅熒光染色法參照Sando等^[8]報(bào)道的方法進(jìn)行。將培養(yǎng)80?d的葉柄愈傷組織塊切成1?mm×1?mm的小塊，80%酒精固定6?h，1 mol/L鹽酸60?℃水浴鍋中處理18 min，6000?g離心5min后棄除上清，ddH₂O清洗愈傷細(xì)胞2次，每次3?min，6000?g離心5?min收集愈傷細(xì)胞。將處理好后的愈傷細(xì)胞浸于50??g/mL的尼羅紅溶液（Sigma）中10?s，ddH₂O清洗2次，將愈傷細(xì)胞均勻涂布于載玻片上，指甲油封片，于熒光顯微鏡下觀察，紫外光波長為420～490?nm。

收集10齡的熱研7-33-97膠乳于冰浴的離心管中，加入4倍體積的含等滲液（10?mmol/L Tris-HCl，250 mmol/L蔗糖，pH?7.0）的尼羅紅溶液（50??g/mL）處理10 s，12?000?g離心10?min后收集上層漂浮物，等滲液清洗2次，將處理后的膠乳物質(zhì)均勻涂布于載玻片上，指甲油封片，于熒光顯微鏡下420～490 nm觀察。

1.2.4 ?免疫組織化學(xué)法??免疫組織化學(xué)法參照Tan等^[4]報(bào)道的方法進(jìn)行。將固定好的80?d葉柄愈傷組織塊進(jìn)行石蠟包埋切片，切片脫蠟后復(fù)水，置于0.01?mol/L檸檬酸鈉緩沖液中于95?℃下處理15?min來修復(fù)抗原，PBS清洗3次，2%牛血清蛋白處理30?min。加入一抗[兔抗小橡膠粒子蛋白（SRPP）抗體，或兔抗橡膠延伸因子蛋白（REF）抗體]（兔抗SRPP、兔抗REF由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所王旭初課題組提供）（按1∶100稀釋）于切片中，將切片置于密封的培養(yǎng)皿中4?℃下孵育過夜。PBS清洗3次，加入二抗（羊抗兔，螯合堿性磷酸酶），37?℃孵育1?h，PBS清洗5次。切片用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色液處理5?min，PBS清洗5次，酒精系列脫水，二甲苯透明，封片后在光照顯微鏡下觀察。

1.2.5??RT-PCR擴(kuò)增葉柄愈傷組織中乳管特異表達(dá)基因??取培養(yǎng)80?d的葉柄愈傷組織塊用植物RNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取其RNA，第一鏈cDNA采用反轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒（Fermentas）進(jìn)行合成。橡膠延伸因子（rubber elongation factor，REF）、小橡膠粒子蛋白（small rubber particle protein，SRPP）和橡膠轉(zhuǎn)移酶（cis-prenyl transferase，CPT）基因是橡膠樹乳管細(xì)胞特異表達(dá)的與膠乳合成相關(guān)的基因^[9-11];橡膠凝集素（Hevein）是膠乳中最豐富的蛋白，具有防御等功能^[12]。通過NCBI網(wǎng)上查詢，獲得了該4個(gè)基因在橡膠樹樹皮膠乳的cDNA序列。它們在GenBank的登錄號分別為HQ640230、HQ640231、EU675683和AY247790。根據(jù)它們的序列應(yīng)用DNAMan軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的擴(kuò)增引物，其中REF-F：5′-GAAGACGA AGACAACCAAC AA G?-3′，REF-R：5′-AAGCCAGAAAACGAGCAG-3′;SRPP-F：5′-GGCTGAAGAGGTGGAGGA-3′，SRPP?-R：5′-GGGCAACAAAGGCAAATA-3′;CPT-F：5′-AAGGTCCCATCCCTACTCAT-3′，CPT-R：5′-?T AGACGGCTCAACCCAGA-3′;Hevein-F：5′-A TAACCTATGTTGTAGCCAGTG-3′，Hevein-R：5′- TGACCTCGTTCATATCCTTT-3′。PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA純化試劑盒（寶生物）純化后送至華大基因測序，對測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對。

2??結(jié)果與分析

2.1組織化學(xué)法鑒定葉柄愈傷組織中乳管細(xì)胞

溴-碘組織化學(xué)染色法是一種經(jīng)典的鑒定植

物乳管細(xì)胞的方法，乳管細(xì)胞的內(nèi)含物被染成棕紅色，易于鑒別，被廣泛應(yīng)用于橡膠樹樹皮乳管分化研究中^[13]。本研究采用該方法對10齡的熱研7-33-97樹干樹皮及其枝條的樹皮進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)樹皮中的乳管細(xì)胞的內(nèi)含物均被染成棕紅色（圖1A，圖1B）。成齡樹樹干樹皮與枝條樹皮的乳管細(xì)胞存在分布上的差異，前者來源于形成層的次生分生組織，為次生乳管^[14]，在韌皮部中成列分布，不同的乳管列之間相互平行（圖1A）;而后者來源于頂端分生組織，為初生乳管^[14]，在組織中隨機(jī)分布（圖1B） 。

葉柄在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)80?d后，其所分化出的愈傷組織為鮮黃色，質(zhì)地緊密，表面有些顆粒狀小突起（圖1C）。對該愈傷組織進(jìn)行溴-碘組織化學(xué)染色，顯微鏡下觀察到一些呈棕紅色的細(xì)胞（圖1D），表明這些細(xì)胞為乳管細(xì)胞。愈傷組織中乳管細(xì)胞的顏色較次生乳管顏色深，而與初生乳管細(xì)胞顏色相近;其分布是隨機(jī)的，有些乳管細(xì)胞相聚在一起，但大部分乳管細(xì)胞是單個(gè)的（圖1D），與初生乳管分布方式相近。愈傷組織存在單寧細(xì)胞，經(jīng)溴-碘染色后變?yōu)楹谏?

同時(shí)還存在淀粉細(xì)胞，該細(xì)胞內(nèi)含有較多的淀粉粒（圖1D）。部分愈傷組織乳管細(xì)胞的內(nèi)含物收縮明顯，聚集于乳管細(xì)胞的中央處，這可能是在制片過程中經(jīng)各種試劑處理，膠乳變性收縮所造成的。

2.2 尼羅紅熒光染色法鑒定葉柄愈傷組織中乳管細(xì)胞

橡膠樹的乳管細(xì)胞主要含有橡膠粒子、黃色體、F-W復(fù)合體、線粒體等，乳管被開割后，這些物質(zhì)從乳管細(xì)胞中流出，形成膠乳^[15]。其中橡膠粒子是膠乳的主要成分，1?mL膠乳中含有4.7×?10¹³個(gè)橡膠粒子^[16]。在可見光下，膠乳中的橡膠粒子為極小的顆粒，經(jīng)尼羅紅染色后，在熒光條

件下橡膠粒子呈現(xiàn)為黃色的小顆粒（圖2A）。葉柄愈傷細(xì)胞經(jīng)1?mol/L鹽酸的處理后，通過尼羅紅熒光染色法發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞中有黃色小顆粒（圖2B），表明該細(xì)胞含有橡膠粒子，應(yīng)為乳管細(xì)胞。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)愈傷組織中存在管狀的乳管（圖2C），是由多個(gè)相鄰乳管細(xì)胞相互融合貫通形成的，乳管細(xì)胞融合貫通后所形成的乳管充滿了橡膠粒子，尼羅紅染色后在熒光條件下整個(gè)乳管呈現(xiàn)黃色（圖2C）。圖2B中的乳管細(xì)胞為乳管細(xì)胞發(fā)育早期，所含的橡膠粒子較少，而圖2C中的相互融合貫通的乳管細(xì)胞為乳管細(xì)胞發(fā)育的晚期，乳管細(xì)胞內(nèi)充滿了橡膠粒子，這也表明乳管細(xì)胞發(fā)育的過程是個(gè)橡膠粒子不斷形成增多的過程。

2.3免疫組織化學(xué)法鑒定葉柄愈傷組織中乳管細(xì)胞

橡膠樹乳管細(xì)胞含有特異的SRPP和REF。石蠟切片的葉柄愈傷組織經(jīng)含有兔抗SRPP或REF的一抗處理后，再與螯合有堿性磷酸酶顯色基團(tuán)的羊

抗兔二抗相結(jié)合，經(jīng)BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色液顯色后，觀察到染成藍(lán)黑色的細(xì)胞，為含有SRPP和REF的細(xì)胞。由于SRPP和REF在乳管細(xì)胞中特異表達(dá)，因此藍(lán)黑色細(xì)胞為乳管細(xì)胞，其內(nèi)含物收縮明顯;而非乳管細(xì)胞沒有被染上顏色（圖3）。

2.4 ?RT-PCR擴(kuò)增葉柄愈傷組織膠乳特異基因

在本研究中，REF、SRPP、Hevein和CPT基因片段均能從橡膠樹葉柄愈傷組織的cDNA中擴(kuò)增出來，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)測序后分別為355、571、439、653 bp（圖4）。對測序結(jié)果進(jìn)行Blast比對，發(fā)現(xiàn)從葉柄愈傷組織中所擴(kuò)增出來的4個(gè)膠乳特異基因的轉(zhuǎn)錄本序列與所報(bào)道的橡膠樹樹皮膠乳中表達(dá)的基因序列一致，進(jìn)一步從分子水平證實(shí)了葉柄愈傷組織存在乳管細(xì)胞，且這些乳管細(xì)胞與樹皮乳管細(xì)胞功能相似。

3??討論

溴-碘染色的組織化學(xué)法可使植物組織中乳管細(xì)胞的橡膠變成不溶于二甲苯的棕紅色物質(zhì)，從而鑒定出乳管細(xì)胞^[13]。尼羅紅染色熒光法通過尼羅紅染料與脂類物質(zhì)相結(jié)合而發(fā)出熒光檢測信號，植物乳管細(xì)胞的膠乳含有脂類物質(zhì)，可通過該方法來鑒定植物乳管細(xì)胞^[8]。但橡膠樹愈傷組織細(xì)胞具有自發(fā)的熒光物質(zhì)^[17]，如果直接采用尼羅紅熒光染色法來鑒定葉柄愈傷組織中乳管細(xì)胞，勢必會有背景熒光的假陽性干擾。本研究用1?mol/L鹽酸60?℃條件下處理葉柄愈傷組織細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)能夠去除愈傷組織細(xì)胞的自發(fā)熒光物質(zhì)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)橡膠粒子與尼羅紅染料結(jié)合，在紫外光條件下橡膠粒子顯示黃色熒光。免疫組織化學(xué)法利用抗原與抗體具有高度特異性結(jié)合的特點(diǎn)，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色基團(tuán)顯示出來，從而確定組織細(xì)胞的抗原，并對其進(jìn)行定性、定位和定量研究^[18]。本研究利用SRPP或REF的特異一抗處理愈傷組織細(xì)胞，愈傷組織中的乳管細(xì)胞的底物SRPP或REF與一抗特異結(jié)合，再經(jīng)含顯色基團(tuán)的二抗處理，經(jīng)顯色處理后乳管細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)黑色。本研究綜合上述3種方法來鑒定葉柄愈傷組織乳管細(xì)胞，為證實(shí)葉柄愈傷組織存在乳管細(xì)胞提供了依據(jù)。

在本研究中葉柄愈傷組織的乳管細(xì)胞分布模式與Tan等^[4]報(bào)道的花藥愈傷組織乳管細(xì)胞的相一致，均為隨機(jī)分布，表明兩者分化方式相似。葉柄含有乳管細(xì)胞，以其為外植體所誘導(dǎo)出的愈傷組織的乳管細(xì)胞的來源尚不清楚，可能來源于愈傷組織中的薄壁細(xì)胞，也可能來源于葉柄乳管細(xì)胞，因此需對葉柄愈傷組織中乳管細(xì)胞的整個(gè)發(fā)育過程進(jìn)行系統(tǒng)研究。

REF、SRPP、CPT是存在于小橡膠粒子膜的蛋白質(zhì)，是參與橡膠樹橡膠合成的重要酶和調(diào)控因子^[9-11]。Hevein存在于橡膠樹黃色體中，乳管被開割后黃色體破裂被釋放出來，具有凝固膠乳和防御病原菌的功能^[12]。本研究從葉柄愈傷組織中擴(kuò)增出該4個(gè)膠乳特異表達(dá)基因的轉(zhuǎn)錄本，且發(fā)現(xiàn)它們的序列與樹皮乳管細(xì)胞的相一致，表明葉柄愈傷組織乳管細(xì)胞與樹皮乳管細(xì)胞功能相似，這為葉柄愈傷組織作為研究乳管分化的新模式提供了科學(xué)依據(jù)。

致謝中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所王旭初課題組為本研究提供兔抗SRPP抗體、兔抗REF抗體，特此致謝！

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