低氧誘導因子-1α(HIF-1α)在年齡相關性白內障晶狀體上皮細胞中的表達△

孫蕾 關麗娜 胡姍姍 于建渤

年齡相關性白內障(age-related cataract，ARC)是一種以晶狀體混濁為主要特征的眼部疾病，糖尿病、高血壓、紫外線和吸煙等是ARC發生和發展的致病因素，而這些因素均可導致機體處于氧化應激狀態[1-7]。氧化應激狀態下產生的過氧化物積累進一步導致晶狀體上皮細胞(lens epithelial cells，LECs)的損傷，出現晶狀體混濁。因此，氧化應激被認為是ARC的主要發病機制[8-9]。低氧誘導因子-1α(hypoxia

inducible factor-1α，HIF-1α)是低氧應激反應的關鍵轉錄調節因子，氧化應激會導致HIF-1α的表達發生變化，HIF-1α在心肌、肝、肺等組織的氧化應激反應中通過不同的機制發揮作用[10-12]。解剖結構上，晶狀體屬于無血管組織，人LECs的天然生存環境處于缺氧狀態，而缺氧會導致HIF-1α的合成增加[13]。目前，尚未有HIF-1α與ARC相關的報道。本研究基于實驗前期已建立的氧化應激誘導SRA01/04凋亡的細胞模型，以及通過建立自然衰老的ARC小鼠模型，并結合臨床收集ARC患者前囊膜標本為基礎，檢測HIF-1α在ARC中的表達情況，以及通過本研究為ARC的治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 體積分數10%胎牛血清、100×103U·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素(美國Gibco公司)，DMEM培養液、磷酸鹽(PBS)緩沖液(美國HyClone公司)，6孔培養板(美國CoStar公司)，細胞凍存瓶、離心管(美國Corning公司)，鼠抗人β-actin單克隆抗體(美國Sigma公司)，兔抗人HIF-1α多克隆抗體(美國Abcam公司)，山羊抗小鼠IgG(G+L)二抗、山羊抗兔IgG(G+L)二抗、兔二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒、檸檬酸鹽修復液、PBS緩沖液粉末、陽離子防脫玻片、中性樹膠(北京中杉生物技術有限公司)，發光試劑盒(美國Millipore公司)。電熱恒溫干燥箱(上海精宏實驗設備有限公色)，漂片儀(常州市郝思琳醫用儀器有限公司)，輪轉切片機、細胞培養箱(美國Thermo Fisher公司)，離心機(美國Sigma公司)。

1.1.2 實驗動物及分組 選用30只Bal/bc小鼠，給予標準實驗室飼養至18個月齡，作為自然衰老小鼠模型納入實驗中，小鼠脫臼處死后顯微鏡下摘除眼球，完整分離晶狀體，篩選出混濁、透明度降低的晶狀體為白內障組；另選用30只Bal/bc小鼠，給予標準實驗室飼養至8個月齡，為青年小鼠模型納入實驗中，小鼠脫臼處死后顯微鏡下摘除眼球，完整分離晶狀體為正常對照組。所取標本于40 g·L-1多聚甲醛中固定(北京維通利華實驗動物技術有限公司提供)。

1.1.3 病例收集與分組 白內障組為2018年1月至10月在牡丹江醫學院附屬紅旗醫院診斷為ARC，并接受白內障手術的住院患者，于術中行連續環形撕囊，收集含有人LECs的晶狀體前囊膜標本10例，年齡60～80歲，排除其他類型白內障以及眼部其他疾病，同時否認有全身性疾病，如糖尿病、高血壓、心血管疾病等。正常對照組為同期我院眼外傷晶狀體脫出患者及角膜移植捐獻的新鮮眼球，收集含有人LECs的透明晶狀體前囊膜標本7例，排除白內障、青光眼、虹膜炎等眼部疾病。所有標本取材后均于40 g·L-1多聚甲醛中固定。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人LECs系(SRA01/04)購于中國廣州吉尼歐生物科技有限公司。培養于含體積分數為10%胎牛血清、100 × 103U·L-1青霉素和 100 g·L-1鏈霉素的DMEM培養液中，置37 ℃、含體積分數5%CO2的恒溫培養箱中。

1.2.2 H2O2處理細胞 將SRA01/04細胞以每孔100×103個置6孔培養板中培養24 h。設置H2O2組和對照組，H2O2組藥物濃度為200 μmol·L-1H2O2，對照組不作處理，藥物作用24 h后進行后續實驗。

1.2.3 Western blot檢測 加入蛋白裂解液提取總蛋白，蛋白上樣后電泳分離蛋白，冰轉法將蛋白轉移至PVDF膜，用50 g·L-1牛血清白蛋白室溫下封閉1 h，加入HIF-1α抗體于4 ℃封閉過夜。加入山羊抗兔(二抗)于37 ℃孵育1 h，ECL發光反應后，暗室曝光顯影。以β-actin為內參，用Image J 軟件對HIF-1α蛋白質含量進行半定量分析。

1.2.4 免疫組織化學檢測 將獲取的人前囊膜標本和小鼠晶狀體標本常規石蠟包埋,組織切片，厚度4 μm。60 ℃ 烤片2 h，常規脫蠟水化后，用pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液高溫高壓修復30 min，室溫冷卻后，H2O2室溫孵育10 min，滴加胎牛血清封閉液30 min，滴加HIF-1α抗體后4 ℃過夜。滴加二抗(兔二步法試劑盒)于37 ℃孵育30 min，DAB顯色后，梯度酒精脫水，甲苯透明，中性樹膠封片。

1.3 統計學方法 采用GraphPad Prism7進行統計學分析。數據以均數±標準差表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩樣本之間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α蛋白在氧化應激的SRA01/04細胞中的表達 Western blot檢測對照組和H2O2組中HIF-1α蛋白表達情況，結果表明，與對照組比較，H2O2組HIF-1α蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01，圖1)。

2.2 HIF-1α蛋白在自然衰老的白內障小鼠LECs中的表達 免疫組織化學檢測小鼠正常對照組和白內障組中HIF-1α蛋白表達情況，結果表明，與正常對照組比較，白內障組小鼠LECs中HIF-1α蛋白表達明顯降低(圖2)。

2.3 HIF-1α蛋白在ARC患者LECs中的表達 免疫組織化學檢測人類正常對照組和白內障組中HIF-1α蛋白表達情況，結果表明，與正常對照組比較，白內障組HIF-1α蛋白表達明顯降低(圖3)。

圖1 Western blot檢測對照組和H2O2組SRA01/04細胞中HIF-1α蛋白的表達。A:對照組和H2O2組HIF-1α蛋白表達水平；B:HIF-1α蛋白灰度值比較。與對照組比較，**P<0.01

圖2 免疫組織化學檢測小鼠正常對照組和白內障組LECs中HIF-1α蛋白的表達。A:正常對照組；B:白內障組。箭頭指代表性區域

圖3 免疫組織化學檢測人正常對照組和白內障組LECs中HIF-1α蛋白的表達。A:正常對照組；B:白內障組。箭頭指代表性區域

3 討論

本研究通過建立氧化應激誘導SRA01/04細胞系凋亡的細胞模型，模擬ARC中LECs的氧化應激狀態，通過Western blot檢測HIF-1α蛋白在LECs的表達變化；另外，通過建立自然衰老的白內障小鼠模型，模擬ARC形成的自然病程，通過免疫組織化學檢測HIF-1α蛋白在小鼠LECs中的表達變化；同時，結合臨床收集ARC患者的前囊膜標本，利用免疫組織化學的方式更準確直觀地檢測HIF-1α蛋白在ARC中LECs的表達，通過這三個層面的實驗結果均顯示，ARC LECs中HIF-1α蛋白的表達降低。

HIF-1是低氧應答的首要轉錄因子，由Semenza等[14]首次發現。HIF-1由HIF-1α和HIF-1β兩個亞單位組成；HIF-1β亞基在細胞內穩定表達，起結構性作用；HIF-1α亞基受低氧信號的調控，是HIF-1的活性亞基[15]。組織內的低氧條件能夠阻斷HIF-1α的泛素化，從而阻斷 HIF-1α的降解途徑，HIF-1α在低氧條件下積累并與HIF-1β結合形成異源二聚體轉運至細胞核內，與基因組中的低氧反應元件結合，調控下游靶基因的轉錄與表達[14]。有研究顯示,HIF-1在低氧條件下能促進糖酵解酶、葡萄糖轉運蛋白、促紅細胞生成素和血管內皮生長因子-A(VEGF-A)的表達，這些基因支持細胞在低氧條件下的存活[16]。

HIF-1α作為機體應對缺氧的重要調節因子，在不同組織的氧化應激反應中產生不同的作用機制。有研究顯示，HIF-1α可通過抑制氧化應激并保護心臟，使其免于膿毒性心肌病導致的功能障礙[17]；也有研究顯示，在高氧和H2O2刺激條件下，腸上皮細胞損傷加重，同時HIF-1α表達升高[18]。在非酒精性脂肪性肝病中，氧化應激參與病變進展，而HIF-1α呈現下降趨勢[11]。嚴重的缺氧或較長時間暴露于輕度缺氧的環境中可引起內皮細胞的強氧化應激反應，并通過HIF-1α的大量積累導致細胞凋亡[19]。

Chang等[20]研究中，常氧高糖條件下，碳水化合物反應元件結合蛋白(ChREBP)介導HIF-1α活化，可能在年齡相關性視網膜病變中參與新生血管的形成。另外，在后囊膜混濁中，LECs的上皮-間質轉化是其病理基礎，而HIF-1α可通過Notch1/Snail1/E-鈣黏蛋白途徑和調節轉化生長因子-β2來促進上皮-間質轉化[21-22]。Chen等[23]在蛋白水平檢測了ARC患者前囊膜中HIF-1α的表達情況，發現其在ARC患者的LECs中表達降低，而且ARC晶狀體混濁的程度越重，HIF-1α的表達也就越低。這與本研究結果吻合，但具體調控HIF-1α低表達的分子機制尚不清楚。

調控HIF-1α的基因眾多。在常氧條件下，HIF-1α可受到脯氨酰羥化酶(prolyl hydroxylase,PHD)蛋白的調節，PHD可羥化HIF-1α并將其靶向蛋白酶體降解；在低氧條件下，線粒體內ROS反常增加，ROS可抑制PHD活性，從而增加了HIF-1α的活性和穩定性[18]。有研究發現，通過H2O2處理細胞誘發抗氧化反應的同時，也誘發抗氧化應激反應，此時作為抗氧化物的谷胱甘肽活性增加，其能抑制HIF-1α的表達；實驗還發現，黃體酮能夠完全消除抗氧化反應，而黃體酮能夠增加HIF-1α的表達[24]。Miranda-Cruz等[15]發現，沉默HIF-1α后能抵抗白斑綜合征病毒感染相關的氧化損傷，即HIF-1α的沉默改善了抗氧化反應，表現為氧化損傷的減少。Xiao等[25]研究發現，HIF-1α參與抑制細胞凋亡和抑制晶狀體混濁，進一步延緩糖尿病性白內障的發展。因此，我們推測ARC中LECs在氧化應激條件下，能夠通過降低HIF-1α蛋白表達進行抗氧化反應，但具體機制還需進一步研究證實。

抗氧化劑可以減少氧化損傷，降低白內障形成的風險。Hayashi等[26]發現，攝入含葉黃素的抗氧化劑后晶狀體前囊膜中LECs的抗氧化酶mRNA表達增加，同時房水中超氧化物的清除活性增加。槲皮素可通過激活人LECs中的HIF-1信號轉導途徑，從而抑制白內障中的晶狀體混濁，而過量的鐵可以逆轉槲皮素誘導的HIF-1α的增加和核轉位[27]。Harned等[28]也發現，鐵可以介導氧化損傷，鐵可用性的增加能降低LECs中HIF-1α的核轉位，而鐵蛋白對鐵的儲存以及防止鐵催化的氧化損傷就顯得尤為重要。Shui等[29]通過向老年小鼠注射鐵螯合劑，使小鼠內可用性鐵降低后可減少LECs中HIF-1α的降解。那么，可用性鐵與鐵蛋白的動態平衡是否也對ARC中HIF-1α產生影響還有待研究。

綜上所述，HIF-1α在ARC的細胞水平和組織水平表達均顯著下降，HIF-1α可能通過特定的機制或通路導致ARC的發生發展，但其確切的發病機制仍需進一步實驗進行研究。本研究為今后實驗提供了明確的方向，為延緩ARC的發生發展提供了理論依據。