miR-155對SD大鼠晶狀體上皮凋亡抑制作用的初步研究

宋 夢，王多梅，汪 楓,2，周 青，汪 淵

晶狀體上皮細胞是位于晶狀體前囊膜最外層的單層細胞，在晶狀體的物質代謝及損傷修復中發揮很大的作用，進而影響整個晶狀體的通透性和內環境的穩定性[1]。在日常生活中，晶狀體極易受到損傷，如紫外線照射、血糖增高、氧化反應、藥物不良反應以及年齡老化等原因均可能損害晶狀體上皮細胞的功能，導致晶狀體上皮細胞凋亡現象發生。微小核糖核酸micro RNA(miR)是長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈[2]。近期，miR-155作為動脈粥樣硬化發病機制的關鍵因素出現，并且miR-155可以在不同細胞中調節炎癥相關性信號通路基因的表達水平[3]。在日常生活中，糖尿病(diabetes,DM)是一種很普遍的疾病，在DM的發生發展過程中伴隨著相關并發癥的發生，其中晶狀體隨著時間延長和病情加重會逐漸渾濁，進而影響視力。該研究觀察miR-155對高糖誘導晶狀體渾濁的影響并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗細胞和動物及生長環境 人晶狀體囊膜上皮細胞(human lens epithelial cells，HLEpiC)購自美國ScienCell公司。20只普通級雄性SD大鼠購自安徽醫科大學實驗動物中心，體質量(270±30)g，眼睛正常無損傷。實驗大鼠均飼養在適合環境中，溫度為20～27 ℃，相對濕度為50%～70%，正常作息光照，自由活動飲水飲食。實驗過程完全符合《實驗動物倫理條例》的規定。

1.1.2藥品及試劑 miR-155購自上海GenePharma公司，-20 ℃保存；胎牛血清購自美國CLARK Bioscience 公司，-20 ℃保存，使用前室溫回溫；DMEM低糖培養基購自美國Gibco公司(DMEM培養基粉末一袋，谷氨酰胺0.58 g，丙酮酸鈉0.11 g，碳酸氫鈉3.7 g，青霉素160 U/ml，鏈霉素100 U/ml，溶于超純水中，混勻后定容至1 L，0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，儲存于4 ℃備用)；磷酸鹽緩沖液(PBS，無Ca2+、Mg2+)：稱取NaCl 8.0 g 、KCl 0.2 g、KH2PO40.2 g、Na2HPO42 g，超純水溶解混勻后定容至1 L，經高溫高壓滅菌(121 ℃、20 min)，冷卻后放4 ℃儲存備用。二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma公司，無菌過濾嘴過濾后，1.5 ml EP管儲存備用。0.25%胰酶：稱取0.25 g胰酶溶于PBS，磁力攪拌器攪勻后定容100 ml，過濾除菌，-20 ℃冰箱儲存。

1.1.3實驗相關儀器 CO2/O2三氣水套式細胞培養箱、低溫離心機和酶標儀(1510)購自美國Thermo Scientific公司；低速離心機購自長沙湘儀離心機儀器有限公司；-80 ℃冰箱購自日本sanyo公司；Milli-Q Direct-8純水儀購自美國Millipore公司；電泳儀和垂直電泳槽購自北京六一儀器廠；制冰機(SCOTSMAN)和倒置、正置熒光顯微鏡(Leica DM3000B、DM4000)購自德國Leica公司；79-1磁力加熱攪拌器購自常州杰瑞爾電器有限公司；電子天平：JY10001，JY2002、精密pH計PHS-3C型購自上海雷磁儀器廠；安徽醫科大學第一附屬醫院眼科提供眼科手術器械。

1.2 方法

1.2.1動物組織體外培養實驗最佳用藥濃度 取質量相同范圍，狀態良好的SD大鼠，4只一籠，正常的適應性飼養1周后取材。10%水合氯醛經腹腔注射麻醉后將鼠仰臥固定，用手指抵住老鼠眼部，將眼球凸出，用剪刀將眼球剪下，用手術鑷子固定眼球，用眼科剪刀將眼球剪破，將晶狀體取出。取出晶狀體進行體外培養，加藥處理，分組包括：低糖(low-glucose group, LG)培養基組、甘露醇組、高糖(high-glucose group, HG)培養基組、miR-155用藥組(mimic)、藥物對照組(control，CTm)。分別在48 h和72 h時收取凍存一份。

1.2.2細胞復蘇、培養和分組 凍存的HLEpiC在37 ℃溫水中快速復蘇，接種于7 ml含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養，隔日換液。細胞長到密度為80%～90%時，開始1 ∶3分瓶傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.3細胞和組織總蛋白的提取 采用Western blot法將不同實驗組的細胞蛋白進行免疫印跡實驗，組織蛋白的提取：配制裂解液，根據每組晶狀體個數不同加入對應體積的裂解液，一個晶狀體加500 μl，兩個加1 ml，記錄好。冰上充分研磨組織，研磨結束后的組織懸液直接放研磨器中置冰上30 min，使細胞充分裂解。用于BCA定量。HLEpiC細胞加藥處理后，冰上操作，棄去培養基，預冷PBS洗3遍，每瓶加入配置好的裂解液200 μl，輕輕搖晃，使得裂解液覆蓋在細胞表面，冰上放置20 min；取出1.5 ml離心管做好標記，冰上預冷；細胞刮刮下細胞層后，將細胞裂解液體吸入對應離心管，冰上靜置30 min，-80 ℃、4 ℃反復凍融3次，于4 ℃、14 000 r/min離心30 min，取上清液至另一新EP管中，用于BCA定量。

1.2.4Western blot 配制聚丙烯酰胺凝膠，膠凝上樣跑膠。準備轉膜用具，裝制轉移“三明治”：海綿—3層濾紙—膠—PVDF膜—3層濾紙—海綿，整個操作在預冷的轉移液中進行；轉膜結束后用5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h。封閉結束后洗膜，放入其對應的一抗中孵育，孵育條件為4 ℃垂直搖床孵育過夜或者更長時間，一抗濃度為：Bax(1 ∶500)、Bcl-2(1 ∶500)、caspase-3(1 ∶250)、procaspase-9(1 ∶500)，視情況而定。PVDF膜用TBST洗3次，TBS洗1次，每次8 min，放入其對應的辣根過氧化物酶標記的二抗(鼠抗濃度為1 ∶1 000，兔抗濃度為1 ∶500)中孵育2 h，。PVDF膜從二抗中取出后，TBST洗3次，TBS洗1次，每次8 min，進行機器顯影；ECL反應液(A液和B液等體積混勻)現配現用，均勻涂在PVDF膜相應條帶位置上。

1.2.5流式細胞術 流式凋亡試劑盒購自美國Invitrogen公司。取一瓶生長至80%的HLEpiC細胞，消化離心，接種于6孔板中，置于細胞培養箱中培養，培養條件為37 ℃、5% CO2。待細胞濃度長到60%后，將mimic和CTm加到培養基中混勻后，分別加到不同的孔中處理48 h。將上清和消化的細胞一起離心，1 000 r/min離心7 min棄上清液，加入2 ml PBS重懸再次離心，重復1遍。傾去上清液，加入稀釋好的1×Annexin V buffer 100 μl重懸后，試管中加入核酸染料(7-amino-actinomycin D，7-AAD)與碘化丙啶(propidium iodide, PI)各2.5 μl混勻，室溫避光反應15 min。每孔加入400 μl Ca2+依賴性磷脂結合蛋白緩沖液(Annexin V buffer)混勻后，上機檢測，1 h內完成。

2 結果

2.1 mimic對SD大鼠晶狀體蛋白中凋亡相關蛋白的影響用30 nmol/L的mimic和30 nmol/L的藥物對照CTm體外培養SD大鼠晶狀體48 h和72 h后收取組織，提取晶狀體總蛋白做Western blot實驗，觀察不同處理組蛋白表達量的變化。48 h時，甘露醇僅作為大分子對照組，與高糖組比較，低糖培養組抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯上升(F=59.721，P<0.05)，與高糖組比較，mimic作為miR-155的激動劑，其抗凋亡蛋白Bcl-2表達量明顯高于高糖培養組(F=37.313，P<0.05)，與高糖組相比，藥物對照CTm組Bcl-2表達量也呈上升趨勢(F=36.113，P<0.05)。而促凋亡蛋白Bax在高糖培養組中表達最多，與高糖組比較，在低糖組Bax表達明顯降低(F=33.09，P<0.05)且miR-155的激動劑mimic組Bax表達量明顯減少(F=7.986，P<0.05)，提示高糖培養能夠促進晶體細胞凋亡的發生，而mimic能改變SD大鼠晶狀體蛋白中凋亡蛋白的表達。各組中caspase 3表達量趨勢與Bax表達量趨勢相同，而procaspase 9表達量趨勢與Bcl-2表達量趨勢一致。見圖1。72 h時，甘露醇僅僅作為大分子對照組。與高糖對照組比較，低糖培養組促凋亡蛋白Bax表達明顯下降(F=21.758，P<0.05)。高糖培養組的促凋亡蛋白Bax表達量明顯高于其他組，與高糖對照組比較，mimic作為miR-155的激動劑，其促凋亡蛋白Bax表達量明顯降低，而其藥物對照CTm組Bax表達量也有下降趨勢(F=158.64，P<0.05)。而抗凋亡蛋白Bcl-2在高糖培養組中表達最少，與高糖對照組比較，在低糖組Bcl-2表達量明顯增加(F=664.424，P<0.05)且miR-155的激動劑mimic組表達量明顯上升(F=38.809，P<0.05)，提示高糖培養能夠促進晶狀體細胞凋亡的發生，而mimic能改變SD大鼠晶體蛋白中凋亡蛋白的表達。見圖2。

2.2 mimic對HLEpiC凋亡的影響前期的晶狀體組織研究結果表明，當用藥濃度為30 nmol/L時，mimic可以明顯抑制晶狀體凋亡現象的發生。流式細胞術分組有雙標組，其中雙標組含有碘化丙啶(propidium iodide, PI)和異硫氰酸熒光素(fluoresceine isothiocyanate,FITC)；miR-155的激動劑mimic組，mimic的藥物對照CTm組，低糖組，甘露醇組，高糖組。并且呈現同樣的結果，各組早期凋亡率(第四象限)和晚期凋亡率(第一象限)之和分別為1.091%、5.756%、6.320%、5.800%、6.381%、16.713%。低糖對照組凋亡細胞明顯很少，與低糖對照組相比，加藥組凋亡細胞比例無太大變化而高糖對照組早期凋亡和晚期凋亡的細胞比例明顯增加，總凋亡的細胞數超過10%。見圖3。所有結果提示mimic用藥濃度為30 nmol/L時可以抑制HLEpiC細胞發生凋亡。

2.3 mimic對HLEpiC中凋亡相關蛋白的影響用30 nmol/L的mimic和30 nmol/L的CTm處理HLEpiC細胞48 h后，提取細胞蛋白做Western blot實驗，觀察不同處理組蛋白表達量的變化。48 h時，甘露醇作為大分子對照組，與高糖組相比低糖培養組procaspase 9表達明顯上升并且mimic作為miR-155的激動劑，其procaspase 9表達量明顯升高(F=496.967，P<0.05)。而caspase 3在高糖培養組中表達最多，與高糖組相比，低糖組caspase 3表達量明顯減少(F=760.859，P<0.05)，并且miR-155的激動劑mimic組caspase 3表達量明顯降低，提示高糖培養能夠促進晶狀體細胞凋亡的發生，而mimic能改變SD大鼠晶狀體蛋白中凋亡蛋白的表達。結果與組織蛋白的結果圖趨勢相同。見圖4。

圖1 miR-155對凋亡相關蛋白表達水平的影響(48 h)

圖2 miR-155對凋亡相關蛋白表達水平的影響(72 h)

A：Bax、Bcl-2蛋白表達；B：caspase-3、procaspase-9蛋白表達；1：低糖組；2：甘露醇組；3：高糖組；4：mimic組；5：CTm組；與高糖組比較：*P<0.05

圖3 miR-155對HLEpiC細胞凋亡的影響

圖4 miR-155對凋亡相關蛋白表達水平的影響

A：Bax、Bcl-2蛋白表達；B：caspase-3、procaspase-9蛋白表達；1：mimic組；2：CTm組；3：低糖組；4：甘露醇組；5：高糖組；與高糖組比較：*P<0.05

3 討論

近年來發現DM是損害包括眼睛在內的全身性疾病。DM可以引起很多的并發癥，包括視網膜病變、腎病綜合征、神經病變和高昂的醫療保健費用[4]。DM患者與非糖尿病患者相比更容易得相應的并發癥，DM患者與非糖尿病患者相比也更容易形成白內障[5-6]。為進一步研究糖尿病性白內障的發病機制以及miR-155在治療白內障過程中的作用。本文采用體外造模的方式，操作相對簡單，實驗周期也相對較短，對于相似實驗均可采用體外造模來驗證。研究[7]顯示miR-155通過下調間充質干細胞中抗氧化相關基因來誘導反應活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生，所以進一步驗證其是否也可以影響晶狀體的抗氧化基因，進而改變高糖對晶狀體的損害作用。研究[8]顯示葡萄糖濃度為20、30、40 mmol/L時，均可造成肺腺癌A549細胞DM相應并發癥的現象，根據預實驗結果選擇葡萄糖濃度為25 mmol/L來進行體外造模實驗，實驗得到的結果表明此濃度的葡萄糖培養基與低糖培養基相比可以促使HLEpiC細胞發生凋亡。

近年來miR-155也廣泛應用于各個疾病治療中，研究[9]顯示miR-155在食物過敏小鼠模型中的作用，可以通過抑制miR-155的表達來抑制小鼠食物過敏的發生，表明miR-155對食物過敏有潛在的治療作用。也有研究[10]顯示內源性miR-155控制死亡配體程序性死亡受體-配體1(programmed cell death-Ligand 1,PD-L1)誘導上調γ-干擾素(γ-interferon,I FN-γ)腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)的最大水平，在真皮纖維母細胞中也獲得了類似的發現，證明IFN-γ/TNF-α/miR-155/PD-L1通道并不局限于人皮膚淋巴管內皮細胞，這些結果表明，miR-155在原發性細胞炎癥引起的炎癥反應中起到了至關重要的作用。通過參考文獻，本文研究了miR-155對高糖誘導的體外培養的晶體是否有治療作用。

本文首先做晶狀體的體外培養實驗，分別在48 h和72 h時提取組織蛋白，通過Western blot實驗得出，高糖培養組在兩個時間段中，促凋亡蛋白的表達量均明顯高于其他組，并且加藥組能夠降低促凋亡蛋白的表達，提高抗凋亡蛋白的表達量。并且在細胞實驗的流式細胞分析以及Western blot實驗中得到了相同的結果。

本課題目的在于研究miR-155是否抑制由高糖引起的晶狀體凋亡現象的發生，通過組織實驗和細胞實驗分別得到驗證，miR-155濃度為30 nmol/L時，可以明顯地抑制高糖引起的晶狀體促凋亡蛋白Bax的表達以及促進其抗凋亡相關蛋白Bcl-2的表達，caspase家族蛋白caspase-3和procaspase-9也有相應的變化，證明高糖可以促進晶狀體凋亡現象的發生。但miR-155是否對其他信號通路有影響尚且不明確，有待進一步研究。