多肽301LARSLKT307對斑馬魚胚胎早期心臟發(fā)育的影響

胡 銀，劉 恒，嚴(yán)湘蕓，莊 斌，陳文娟，王星云，韓樹萍，余章斌

法洛四聯(lián)癥是常見的復(fù)雜先天性心臟病，其發(fā)生率約占活產(chǎn)嬰兒的4‰，死亡率則達(dá)5%以上，且需二次手術(shù)的患兒高達(dá)30%[1]，給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。早期診斷及早期治療可以顯著提高患兒的存活率。本課題組早期利用氣-液聯(lián)動質(zhì)譜技術(shù)，對法洛四聯(lián)癥流產(chǎn)胎兒心肌組織進(jìn)行多肽組學(xué)進(jìn)行分析[2]，發(fā)現(xiàn)TALIN-1結(jié)構(gòu)域來源的多肽301LARSLKT307含量較對照組有顯著差異，提示這條多肽可能與心臟的發(fā)育及功能相關(guān)。為了驗證此假設(shè)，該研究用顯微注射技術(shù)將多肽注射入斑馬魚受精卵，構(gòu)建胚胎發(fā)育模型，研究在此條件下該多肽對心臟發(fā)育的影響。

斑馬魚的心臟發(fā)育，在基因表達(dá)、形態(tài)發(fā)生以和生理特性上均與哺乳動物高度相似[3]。并且，斑馬魚胚胎在體外受精與發(fā)育、胚胎透明、產(chǎn)量大，且可不完全依賴于心血管系統(tǒng)存活[4]。斑馬魚心臟發(fā)育迅速，72 h即可完成胚胎期心臟發(fā)育[5]，相當(dāng)于人類妊娠8周內(nèi)心臟發(fā)育的過程。這些優(yōu)勢使得斑馬魚成為心臟發(fā)育研究的重要模型。該研究從多肽對斑馬魚的生長發(fā)育過程的影響入手，為闡明多肽與胚胎心臟發(fā)育畸形的內(nèi)在機(jī)制提供理論依據(jù)和線索，以期望能夠?qū)θ祟愊忍煨孕呐K病的診斷及治療的研究方面有所幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物Tubingen品系野生型成年斑馬魚購自南京大學(xué)模式動物研究所，雌雄斑馬魚分缸飼養(yǎng)，每日予光照14 h、黑暗10 h的人工光照周期；成年斑馬魚予脫殼豐年蟲喂食3次/d。實驗前12 h，將成年雌雄斑馬魚等比例配對移入交配缸，并用擋板分開，次日亮燈前抽取擋板，光照刺激促排卵，15 min后收集胚胎。收集的胚胎置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，及時更換培養(yǎng)液并挑出死亡的胚胎，防止影響其他胚胎發(fā)育。

1.2 試劑與儀器

1.2.1主要試劑 多肽及對照隨機(jī)亂序肽均委托北京澤溪源公司化學(xué)合成，序列分別為LARSLKT和ALKTLRS；原位雜交RNA探針:心肌肌球蛋白輕鏈2型基因(cardiacmyosin light chain-2，cmlc2)、心室肌球蛋白重鏈基因(ventricular myosin heavy chain，vmhc)、心房肌球蛋白重鏈基因(atrtal myosin heavy chain，amhc)由南京市婦幼保健院醫(yī)學(xué)研究中心贈送；Tween-20購自美國Amresco公司；甲酰胺購自美國Promega公司；酵母RNA、多聚甲醛、蛋白酶K、色素抑制劑、馬來酸、左旋咪唑、苯甲酸、苯甲醇、甲基纖維素、三卡因均購自美國Sigma公司；封閉劑、地高辛抗體、地高辛標(biāo)記的UTP、顯色液、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、對甲苯胺藍(lán)(BCIP)均購自德國Roche公司；TRIzol購自美國Invitrogen公司；動物組織總RNA提取試劑盒購自北京天根公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Premix Ex TaqTM II購自日本TAKARA公司；余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2.2主要試驗儀器 隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱(型號：PYX-DHS)購自上海躍進(jìn)公司；Olympus體式顯微鏡(型號：MVX-TV0.63XC)購自日本Olympus公司；徠卡立體顯微鏡(型號：MZ16F)購自英國Leica公司；原位雜交爐(型號：HL-2000 Hybrilinker)購自美國UVP公司；Real-time PCR儀(型號：ViiA 7)購自美國UVP公司。

1.3 實驗方法

1.3.1實驗分組與多肽的顯微注射 將1次所產(chǎn)的胚胎隨機(jī)分為3組，野生型組(WT)、實驗多肽注射組(PEP)、對照多肽注射組(NC)。PEP組在45 min內(nèi)(斑馬魚胚胎1細(xì)胞期)進(jìn)行顯微注射，每個胚胎注射10 μmol/L的實驗多肽液1 nl于受精卵的卵黃囊部位。NC組的胚胎在45 min內(nèi)注射10 μmol/L的對照多肽液1 nl于受精卵的卵黃囊部位。WT組正常生長，不作處理。注射完成后，胚胎立即置于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，及時更換培養(yǎng)液并挑出死亡的胚胎，防止影響其他胚胎發(fā)育。

1.3.2斑馬魚心率計數(shù) 將斑馬魚胚胎置于3%甲基纖維素中，于顯微鏡下計數(shù)斑馬魚胚胎1 min心跳數(shù)，得到心率。

1.3.3斑馬魚胚胎原位雜交 收集不同發(fā)育時期的胚胎，每管40個胚胎。胚胎撕掉鞘膜，用4%的多聚甲醛固定過夜后，25%、50%、75%、100%甲醇梯度脫水，保存于-20 ℃。原位雜交時，25%、50%、75%、100%的PBST梯度水化胚胎，4%多聚甲醛固定20 min，蛋白酶K(20 μg/ml)處理20 min，緩沖液反復(fù)清洗后，轉(zhuǎn)移到hyb-液中，65 ℃雜交爐孵育5 min，換入hyb+液預(yù)雜交4 h，接著加入含有1 ng/μl的RNA探針(cmlc2、vmhc、amhc)的hyb+液，65 ℃雜交爐中過夜，SSC溶液反復(fù)洗去非特異性結(jié)合的探針，然后換入封閉液室溫封閉1 h終止反應(yīng)，之后換為含有1/4 000體積地高辛抗體的封閉液，4 ℃過夜，MABT室溫洗滌，用于洗去非特異性結(jié)合的抗體，依次加入平衡液和顯色液進(jìn)行避光顯色4 h。顯色結(jié)束后用緩沖液清洗，進(jìn)一步洗去非特異性信號，將胚胎置于包埋液(苯甲酸與苯甲醇按2 ∶1配制)，于徠卡立體顯微鏡下拍照并采集圖像。

1.3.4RNA的提取及cDNA的制備 收集12 h的三組斑馬魚胚胎各20個，加入0.7 ml TRIzol，用勻漿器充分研磨。室溫靜置10 min后，加入140 μl氯仿，震蕩混勻，4 ℃、10 400 r/min離心15 min；轉(zhuǎn)移上層液體到新的離心管，加入1.5倍體積的乙醇充分混勻，轉(zhuǎn)移至RNeasy，室溫10 400 r/min離心1 min，棄廢液；向吸附柱中加入350 μl RW1，10 400 r/min離心1 min，重復(fù)1次；加入500 μl RW，室溫2 min后10 400 r/min離心1 min，棄廢液，重復(fù)1次；空轉(zhuǎn)10 400 r/min離心1 min，置于通風(fēng)處放置5 min，向吸附柱中加入50 μl水，室溫靜置2 min，將吸附柱轉(zhuǎn)移至另一1.5 ml離心管，10 400 r/min離心2 min。核酸定量儀讀OD值測出濃度，A260/A280為1.8～2的判定質(zhì)量較好。加入2.0 μl 5×gDNA Eraser Buffer、1.0 μl gDNA Eraser、1 μg斑馬魚總RNA，用DEPC水定容到10 μl，混勻之后，42 ℃反應(yīng)2 min，冰上放置2 min以去除基因組DNA；加入4.0 μl 5×PrimeScript? Buffer 2(for Real Time)、1.0 μl PrimeScript? RT Enzyme Mix I、1.0 μl RT Primer Mix，DEPC水定容到20 μl，此過程在冰上進(jìn)行，混勻之后37 ℃反應(yīng)15 min，85 ℃反應(yīng)5 s，所得cDNA貯存在-20 ℃。

1.3.5實時定量PCR(qPCR) 采取SYBR Green法進(jìn)行實時定量PCR，使用的相關(guān)引物見表1，模板為胚胎12 h的cDNA，10 μl反應(yīng)體系，其中包括5 μl 2×SYBR Green Master Mix，0.5 μl 的正向引物(10 μmol/L)和反向引物(10 μmol/L)，50 ng cDNA，0.2 μl Rox，加DEPC水定容至10 μl。將上述體系試劑加入384空板中，放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行40個循環(huán)的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：50 ℃ 2 min；95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s；60 ℃ 31 s。擴(kuò)增結(jié)束后所得CT值采用相對定量法以β-actin為內(nèi)參基因計算目的基因表達(dá)量的比值，用Fold值表示，用標(biāo)準(zhǔn)的t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

表1 實時定量PCR目的基因的引物

1.4 多肽的基本生物信息學(xué)分析通過NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/)在線網(wǎng)站查找多類物種的TALIN-1前體蛋白序列；采用Uniprot(http://www.uniprot.org/)蛋白數(shù)據(jù)庫Blast方法確定該肽的位置及其與前體蛋白和結(jié)構(gòu)域間的關(guān)系；使用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)在線數(shù)據(jù)庫分析該肽的理化性質(zhì)特征。

2 結(jié)果

2.1 多肽301LARSLKT307的生物學(xué)信息通過NCBI在線網(wǎng)站查找出包括斑馬魚及人類在內(nèi)多類物種的序列，發(fā)現(xiàn)在這些物種中，TALIN-1蛋白的該段多肽序列高度一致(圖1A)，這種進(jìn)化上的高度保守性提示TALIN-1蛋白的該段序列肽，可能在生物的發(fā)育過程中起重要作用。利用質(zhì)譜定量技術(shù)，對這條肽進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1B。通過Uniprot在線網(wǎng)站查詢得知，該條肽的前體蛋白TALIN-1主要位于細(xì)胞膜及細(xì)胞骨架中，該肽位于其前體蛋白的301～307氨基酸位點，在其前體蛋白的B41結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該結(jié)構(gòu)域的功能是與細(xì)胞膜相結(jié)合，在細(xì)胞膜的組裝和穩(wěn)定中起支撐和調(diào)節(jié)作用。這條肽處于該結(jié)構(gòu)域中，可能可以發(fā)揮與之相同或相反的功能。通過ProtParam tool查找發(fā)現(xiàn)該多肽在真核生物中的半衰期是5.5 h，不穩(wěn)定系數(shù)為59.21；親脂系數(shù)(aliphatic index)為：125.71，親水系數(shù)(grand average of hydropathicity)為-0.07，這提示該肽是脂溶性較親水性強(qiáng)的多肽，易通過擴(kuò)散或者胞吞的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

2.2 多肽對斑馬魚心包的影響為更進(jìn)一步了解斑馬魚心臟發(fā)育情況，顯微注射后利用立體顯微鏡記錄下斑馬魚發(fā)育36、48和72 h各組的心臟的發(fā)育情況(圖2)。研究表明PEP組的斑馬魚在36 h已開始出現(xiàn)輕微的心包水腫，隨著時間的遷移，斑馬魚心包的水腫情況越來越明顯。

2.3 多肽對斑馬魚心率的影響心率是衡量心臟功能的重要指標(biāo)，是衡量多肽對心臟發(fā)育影響的重要依據(jù)。分別計數(shù)36、48、72 h各組斑馬魚的心率，每組每個時間點計數(shù)至少10條斑馬魚。36 h斑馬魚心率WT組為(150.20±7.16)次/min、NC組為(150.00±8.84)次/min、PEP組為(87.20±15.14)次/min；48 h斑馬魚心率WT組為(143.67±6.15)次/min、NC組為(142.25±7.58)次/min、PEP組為(120.75±11.80)次/min；72 h斑馬魚心率WT組為(174.73±5.98)次/min、NC組為(171.18±5.98)次/min、PEP組為(161.73±10.44)次/min，具體的結(jié)果見圖3。WT組與NC組斑馬魚胚胎心率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，36、48和72 h的P值分別為0.96、0.62、0.12。但與WT組相比，PEP組各時間點的心率均呈下降趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，36、48、72 h的P值分別為5.82E-10、5.30E-06、1.02E-03。

2.4 原位雜交檢測多肽對心臟環(huán)化的影響收集斑馬魚48 h的胚胎，利用cmlc2、amhc、vmhc這3種分別標(biāo)記斑馬魚的心臟整體、心房和心室的探針，與斑馬魚胚胎原位雜交，顯色后使得心臟的形態(tài)在立體顯微鏡下得以顯示，以此來研究多肽處理對心房心室發(fā)育的影響。結(jié)果顯示，WT組與NC組均能正常環(huán)化，心房心室呈S型，但PEP組心臟卻未見明顯環(huán)化(圖4)。

2.5 qPCR檢測多肽對心臟祖細(xì)胞分化的影響本研究對發(fā)育12 h的斑馬魚胚胎進(jìn)行相關(guān)基因qPCR檢測，包括祖細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)基因mef2c、nkx2.5和心臟房室發(fā)育相關(guān)基因amhc、vmhc。以WT組的各基因相對表達(dá)量為1，PEP組各基因的相對表達(dá)量amhc(0.37±0.05)、vmhc(0.248±0.072)、mef2c(0.092±0.014)、nkx2.5(0.56±0.127)，各基因的表達(dá)出現(xiàn)不同程度的降低，P值分別為6.73E-04、1.85E-02、2.02E-05、1.08E-01，除nkx2.5，其余均小于0.05(圖5)，這說明多肽301LARSLKT307對于胚胎心臟發(fā)育的影響，從心臟祖細(xì)胞時期的細(xì)胞分化就已經(jīng)有影響，但對于mef2c的影響作用強(qiáng)于對nkx2.5的影響。

圖1 多肽301LARSLKT307生物學(xué)基本特征分析

圖2 多肽301LARSLKT307處理對斑馬魚心臟發(fā)育的影響 ×120

A、D、G：野生型斑馬魚發(fā)育的大體形態(tài)；B、E、H：對照多肽處理對斑馬魚發(fā)育大體形態(tài)的影響；C、F、I：實驗多肽處理對斑馬魚心包水腫的影響

圖3 多肽301LARSLKT307對斑馬魚心率的影響

3 討論

多肽能夠影響心臟的發(fā)育與功能，對于治療和預(yù)測心血管疾病有著巨大的潛力。多肽301LARSLKT307是在法洛四聯(lián)癥心臟組織中發(fā)現(xiàn)的一條TALIN-1來源的多肽。TALIN-1是細(xì)胞黏附的關(guān)鍵蛋白，對于維持心臟Z-盤穩(wěn)定和內(nèi)皮完整性是必要的[6]。且這條多肽位于起支撐和調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的組裝和穩(wěn)定作用的B41結(jié)構(gòu)域中。多肽301LARSLKT307所處的前體蛋白及其結(jié)構(gòu)域，對于心臟的功能及結(jié)構(gòu)的影響均已有文獻(xiàn)報道。但是由TALIN-1蛋白的結(jié)構(gòu)域剪切所產(chǎn)生的多肽對于心臟的發(fā)育與功能是否存在影響，還沒有相關(guān)研究。本課題組在斑馬魚發(fā)育1細(xì)胞期，通過顯微注射構(gòu)建多肽301LARSLKT307處理的斑馬魚胚胎實驗?zāi)Ｐ汀Ｉ镄畔W(xué)分析顯示這條多肽是脂溶性較強(qiáng)的多肽，易于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，是多肽可能在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的前提條件。雖然這條多肽的半衰期為5.5 h，但斑馬魚的心臟發(fā)育是一個連續(xù)而協(xié)調(diào)的過程，造成的影響可能是長期而深遠(yuǎn)的。根據(jù)研究結(jié)果，PEP組的斑馬魚胚胎出現(xiàn)心率降低、心包水腫、心臟的環(huán)化及祖細(xì)胞的分化受到影響。這些都提示這條多肽能夠影響斑馬魚心臟的發(fā)育及功能的行使。

心臟的泵血功能受心率及每搏輸出量影響。本研究顯示，與WT組及NC組比較，PEP組的斑馬魚出現(xiàn)心率下降的情況，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。心包水腫會使得心包腔內(nèi)壓力增大，妨礙房室的舒張充盈，使得每搏輸出量降低。心率降低與心包水腫綜合作用，使得心臟每分搏出量更加降低，影響心臟泵血功能，說明多肽能夠影響心臟的功能。

圖4 原位雜交觀察多肽注射對于心臟房室環(huán)化的影響 ×120

圖5 qPCR檢測多肽對12 h時斑馬魚胚胎心臟發(fā)育相關(guān)基因的影響

1：amhc；2：vmhc；3：mef2c；4：nkx2.5；與WT組比較：*P<0.05，***P<0.001

斑馬魚心臟的發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，包括胚胎前端中軸兩側(cè)的側(cè)板中胚層細(xì)胞(祖細(xì)胞)分化成心臟前體細(xì)胞、前體細(xì)胞向中軸遷移匯聚、融合成原始心管、房室分化完成、心臟環(huán)化和瓣膜的發(fā)生與成熟[7]。其中，心臟環(huán)化為多腔室器官的形成提供條件，是脊椎動物心臟發(fā)育過程中關(guān)鍵的形態(tài)發(fā)育事件，法洛四聯(lián)癥的出現(xiàn)與心臟的環(huán)化異常高度相關(guān)[8]。心臟環(huán)化異常可導(dǎo)致房室間隔發(fā)育延遲，動脈干未及時反向轉(zhuǎn)動及位置異常，因而導(dǎo)致心腔和血管之間組裝出現(xiàn)問題，這是法洛四聯(lián)癥出現(xiàn)的重要病理機(jī)制。原位雜交是一種應(yīng)用標(biāo)記探針與組織細(xì)胞中的待測核酸雜交，再應(yīng)用標(biāo)志物相關(guān)的檢測系統(tǒng)，在核酸原有的位置將其顯示出來的一種檢測技術(shù)。本研究選用cmlc2、vmhc和amhc這些在斑馬魚心臟房室特異性表達(dá)的基因探針進(jìn)行原位雜交，來觀察心臟的發(fā)育。cmlc2是心肌輕鏈2型，特異性在整個心臟表達(dá)；vmhc是心室肌球蛋白重鏈基因，特異性在心室表達(dá)；amhc是心房肌球蛋白重鏈基因，特異性在心房表達(dá)，是心房肌的分化標(biāo)志物。研究[5]表明正常斑馬魚胚胎在48 h心臟環(huán)化已經(jīng)完成，心房心室呈S型。本研究顯示胚胎發(fā)育48 h時，PEP組的斑馬魚心臟環(huán)化尚未完成，證實多肽301LARSLKT307能影響斑馬魚胚胎心臟的環(huán)化，說明該多肽對于心臟的結(jié)構(gòu)也存在影響。

為了進(jìn)一步深入了解多肽301LARSLKT307對心臟功能和結(jié)構(gòu)影響的機(jī)制，本實驗對心臟祖細(xì)胞分化發(fā)育相關(guān)基因mef2c、nkx2.5及房室發(fā)育相關(guān)基因amhc、vmhc進(jìn)行檢測。nkx2.5是前部側(cè)板中胚層心臟祖細(xì)胞分化的標(biāo)記基因[9]。mef2c是最早在心臟中表達(dá)的mef2家族基因，與nkx2.5一起促進(jìn)心肌細(xì)胞的分化[10]。實驗發(fā)現(xiàn)，PEP組中這些基因的表達(dá)較野生型組及NC組降低，說明多肽301LARSLKT307對于斑馬魚胚胎心臟房室發(fā)育的影響，是從心臟祖細(xì)胞時期就已經(jīng)存在，且可影響心臟祖細(xì)胞的分化。祖細(xì)胞的分化程度降低可能是房室發(fā)育異常的原因，而心率的減慢及心臟環(huán)化的異常也可能與心臟祖細(xì)胞的分化受阻相關(guān)。

綜上所述，法洛四聯(lián)癥來源的多肽301LARSLKT307能夠在胚胎期顯著抑制心臟的發(fā)育與功能，這可能是通過影響心臟祖細(xì)胞的分化所導(dǎo)致。本研究為深入探討多肽在心臟發(fā)育及功能中的影響奠定了基礎(chǔ)，同時也為先天性心臟病的早期診斷和治療提供了新的靶點和思路。