超小氧化釓點綴的介孔二氧化硅作為磁共振T1造影劑的實驗研究

司元純，張桂龍，王 丹，吳正巖，鄒多宏，陳喬爾

磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)造影劑是一類能夠增強局部軟組織圖像對比度的物質，T1造影劑主要通過改變水質子的自旋-晶格馳豫時間，使病灶組織圖像變的更亮，增強微小病灶與正常組織間的信號差異，為圖像診斷提供有力的影像信息[1-2]。臨床上應用的主要是T1造影劑，如二乙三胺五乙酸釓(gadolinium-diethylenetriaminepentaacetic acid,Gd-DTPA)。Gd-DTPA是一種小分子造影劑，其在體內代謝時間較短，難以獲得病灶組織的高分辨影像，且縱向弛豫率僅有4～5 mmol-1·s-1，遠遠未達到釓(gadolinium，Gd)離子的理論弛豫率，這為研究人員對高性能釓基納米造影劑的開發提供了巨大的提升空間[3-5]。該研究將具有順磁性的氧化釓(gadolinium oxide，Gd2O3)整合到比表面積大、生物兼容性好的介孔二氧化硅(silicon dioxide，SiO2)的表面，保證Gd與水分子的有效接觸，來產生更強的造影效果。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料十六烷基三甲基溴化胺(cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB)、三乙醇胺(triethanolamine，TEA)、正硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate，TEOS)購自上海阿拉丁公司；六水合氯化釓 (hexahydrated gadolinium chloride，GdCl3·6H2O)購自美國Sigma-Aldrich公司；細胞技術試劑盒(CCK-8)購自日本Dojindo公司。

1.2 儀器使用透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100F，日本JEOL公司)觀測樣品的形態；通過動態光散射粒度分析儀(DLS，Nanotrac Wave Ⅱ，美國Microtrac公司)檢測粒徑；孔隙率分儀(BET, Tristar Ⅱ，3020M，美國Micromeritics公司)測量樣品的氮吸附-脫附等溫曲線；采用X射線衍射儀(XRD，TTR-Ⅲ，日本Rigaku公司)分析晶體結構；使用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR，iS10，美國Nicolet公司)檢測有機共價鍵；熱重分析儀(TGA, Q5000IR, 美國TA 公司)進行材料的熱重分析；通過電感耦合等離子體光學發射光譜法(inductively coupled plasma optical emission spectrometer, ICP-OES，ICAP7200，美國Thermo Fisher Scientific公司)測定Gd離子濃度。

1.3 材料合成

1.3.1合成SiO2取50 ml錐形瓶，加入 2 g CTAB、20 μl TEA和20 ml超純水，在磁力攪拌下，升溫到80 ℃，保持此溫度20 min后，逐滴加入1.5 ml TEOS，反應4 h。12 000 r/min離心10 min收集，60 ℃鼓風干燥箱內烘干，瑪瑙研缽磨成粉，置于陶瓷坩堝中，在馬弗爐中600 ℃煅燒6 h，得到SiO2。

1.3.2合成不同梯度Gd2O3鑲嵌的SiO2另取5組50 ml錐形瓶，分別編號為②、③、④、⑤、⑥，分別加入2 g CTAB，20 μl TEA和20 ml超純水，在磁力攪拌下，升溫到80 ℃，保持此溫度20 min后，逐滴加入1.5 ml TEOS，反應4 h。然后，編號②、③、④、⑤、⑥的錐形瓶中，分別加入1 ml不同濃度(0 、0.001、0.01、0.1、0.5 g/ml)的GdCl3·6H2O溶液，繼續反應2 h，然后分別逐滴加入1 ml TEOS, 4 h后，12 000 r/min離心10 min收集。將上述6組離心產物分別收集至潔凈容器中，置于60 ℃鼓風干燥箱內烘干，使用瑪瑙研缽磨成粉，分別置于陶瓷坩堝中，在馬弗爐中600 ℃煅燒6 h，編號為②、③、④、⑤、⑥煅燒后得到的產物，分別命名為SG0、SG0.001、SG0.01、SG0.1、SG0.1和SG0.5。

1.4 SG0.1的結構表征將適量SG0.1超聲分散至無水乙醇中，再將混合溶液滴加到含有無定形碳膜的銅網上，烘干后放入到高分辨率投射電子顯微鏡中進行觀察，觀察SG0.1的形貌、尺寸和表面結構，X-射線能譜儀測量納米材料中Gd的相對含量。

1.5 SG0.1的馳豫率測定制備不同Gd濃度(0、4.375、8.75、17.5、35、70 μmol/L)SG0.1的瓊脂糖溶液封裝于2.0 ml離心管中，使用臨床磁共振掃描器(Sigma HDxt 3.0 Tesla MRI 系統)，通過飽和恢復法自旋回波序列(回波時間=10 ms，脈沖時間=4 000、2 000、1 000、600、300、150 ms)獲取T1加權的磁共振圖像，并測得不同核磁管的縱向弛豫時間T1。使用ICP測定Gd離子濃度。通過縱向馳豫值的倒數/Gd離子濃度的線性擬合，來計算縱向弛豫率(longitudinal relaxation rate，r1)。

1.6 Gd離子泄露研究取SG0.1(5 mg)分別分散于含有pH為7.4、6.5、5.5、4.5和2.0 的4 ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)離心管中，另取SG0.1(5 mg)于10 ml試管中，加入2 ml濃硝酸和2 ml去離子水，在37 ℃水浴中靜置72 h，用高速離心機12 000 r/min離心10 min，隨后用電感耦合等離子體原子發射光譜儀(ICP)檢測上清液中Gd離子的濃度。

1.7 細胞培養和細胞毒性測定將牙髓干細胞(dental pulp stem cell，DPSC)接種在96孔板中，應用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養液培養DPSC，置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱內培養。當細胞增殖融合達培養皿80%時，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，然后將兩組DPSCs用不同濃度SG0.1分別處理24 h和48 h，除去培養基，并用PBS洗滌細胞。使用CCK-8試驗測定細胞存活量。

2 結果

2.1 結構表征SiO2具有最高的比表面積，在加入TEOS后，比表面積降低了50%，隨著GdCl3·6H2O的添加量逐漸增大，比表面積逐漸增大，加入0.1 g時，比表面積最大，為661 cm3/g，繼續提高添加量，比表面積開始減小。見圖1A、1C。不同梯度的納米粒子，均具有明顯的介孔孔道結構，SiO2孔容積最大，隨著加入的GdCl3·6H2O劑量逐漸增大，納米粒子的介孔孔徑逐漸減小，直徑均小于4 nm，且孔容積逐漸降低。在添加不同GdCl3·6H2O濃度梯度中，SG0.1具有最高的比表面積，且在孔直徑為1.6 nm時，孔容積最大。見圖1B、1D 。

透射電子顯微鏡結果：合成后的納米粒子呈球形，粒度分布窄，尺寸均一，粒徑大小約50 nm, 具有明顯的孔道結構，SG0.1在50、20、5 nm尺度下，均可明顯看到Gd2O3納米點，白色圈標記的為超小Gd2O3，不具有晶格結構，為無定形形態。見圖 2。

X射線能譜圖，X射線能譜分析儀(energy dispersive spectrometer，EDS)展現出納米復合材料中存在明顯的Gd元素，直接說明了納米Gd2O3被成功整合在介孔硅中。見圖3A。材料中硅元素與Gd元素的相對含量見圖3B，Gd的相對質量占比為0.44%，原子百分比為0.08%。通過電感耦合等離子體原子發射光譜儀測得納米復合材料(SG0.1)中Gd元素的質量百分比為1.6%(5 mg SG0.1經50%硝酸消解72 h后，ICP測得的Gd離子含量為80 μg)。

動態光散射粒度分析儀檢測結果表明，SG0.1具有較窄的粒徑分布，水合粒徑約為200 nm，見圖4A，這些結果說明SG0.1在溶液中具有較好的穩定性。X射線衍射結果顯示SG0.1中SiO2的吸收峰變弱，且沒有新的吸收峰出現，見圖4B，這說明整合在SiO2中的Gd2O3為無定形形態。傅里葉紅外結果顯示，SiO2和SG0.1在1 100 cm-1明顯的吸收峰和在1 150 cm-1～1 250 cm-1較弱的吸收帶歸屬于Si-O非對稱伸縮峰；在800 cm-1的吸收峰，屬于Si-O-Si對稱伸縮振動，在465 cm-1屬于Si-O彎曲振動；此外，2 850 cm-1和2 925 cm-1為C-H伸縮振動，1 470 cm-1為C-H鍵的彎曲振動，見圖4 C，說明SG0.1煅燒前含有有機物CTAB，而相應的峰位在煅燒后消失，表明CTAB被完全去除。熱重分析儀(thermal gravimetric analyzer, TGA)檢測結果見圖4D，通過TGA檢測SG0.1的水分和有機含量，測試溫度從室溫(20 ℃)開始，以20 ℃/min的升溫速率，升到820 ℃。SG0.1(煅燒前)熱重數據顯示，溫度小于200 ℃的重量損失主要由于水分子的損失(包含自由水和結合水)，失重量為2.28%，溫度在200～600 ℃之間的重量損失，主要是由于有機物模板劑(CTAB)煅燒分解產生的，失重量為43.17%，由此可知，煅燒前的產物中，有機物質量比為43.17%。600 ℃以后趨于平穩。SG0.1(煅燒后)在小于100 ℃區段內，失重量為5.68%；200 ℃以后基本趨于平穩，說明有機物在煅燒后已經完全去除。

圖1 不同氧化釓含量點綴的二氧化硅的比表面積及孔徑分布圖

A、B：分別為不同組份(SiO2、SG0、SG0.001、SG0.01、SG0.1及SG0.5)組合的氮氣吸附-脫附曲線圖和孔徑分布圖；C：上述各組份的比表面積柱狀圖；D：SG0.1的氮氣吸附-脫附曲線圖(Ⅰ)和孔徑分布圖(Ⅱ)

圖2 SG0.1在不同放大倍數下的透射電鏡圖

圖3 X射線能譜分析

圖4 SG0.1的材料表征

A：SG0.1的水合粒徑分布圖；B：SiO2和SG0.1的X射線衍射圖；C：SG0、SG0.1煅燒前和SG0.1煅燒后的紅外圖譜；D：SG0.1煅燒前和SG0.1煅燒后的熱重分析

2.2 SG0.1的馳豫率在場強為3.0 T的磁共振掃描器中，測得SG0.1縱向馳豫率r1為45.1 mmol-1·s-1，是Gd-DTPA的10倍(r1=4.2 mmol-1·s-1)，線性度高(R2= 0.99，R2是決定系數)，SG0.1的明暗圖表明隨著Gd離子濃度逐漸增加，T1加權圖像逐漸變亮，見圖5。這些數據均表明制備的SG0.1具有較高的磁共振造影性能。

圖5 SG0.1的磁共振性能表征

A: 1/T1-Gd濃度線性圖，計算SG0.1的縱向弛豫率；B:不同Gd離子濃度的明暗圖(場強3.0T)

2.3 SG0.1體外穩定性研究溶酶體和核內體是細胞內酸性最強的細胞器，pH通常在4.5～6.5之間。SG0.1在pH≥4.5的磷酸鹽溶液中，Gd離子幾乎不泄露，即使pH 2.0磷酸鹽溶液中處理72 h，也僅有不到1%的泄漏，表明SG0.1具有極佳的酸穩定性能。見圖6。

2.4 SG0.1的生物兼容性研究為了研究SG0.1的生物兼容性，通過CCK-8來評價其對細胞的毒性。

圖6 不同pH的磷酸鹽緩沖液中SG0.1的Gd3+釋放量

在培養時間為24 h及48 h時，不同濃度SG0.1與對照組(0 μg/ml)比較，進行單因素方差分析。24 h的數據中，細胞存活率較低的幾組數據(濃度為5 、10 、20 、40 μg/ml)與0 μg/ml單因素比較，細胞存活率差異無統計學意義(F=2.640，P>0.05)。其他濃度組與對應0 μg/ml比較，細胞存活率差異有統計學意義 (24 h：F=12.77，P<0.05; 48 h:F=12.07，P<0.05)，但細胞存活率增加而未降低。見表1、圖7。這些結果說明SG0.1納米造影劑具有很好的生物安全性。

表1 24 h和48 h細胞存活率

圖7 梯度濃度SG0.1與牙髓干細胞共培養24、48 h的細胞存活率

3 討論

磁共振成像技術具有無電離輻射、高空間分辨率、穿透深度不受限制等特點，已廣泛用于臨床診斷[6]。目前MRI檢查中，約有30%的檢查需要用到MRI造影劑來增強局部造影能力，而目前臨床使用的造影劑主要是Gd的螯合物(如Gd-DTPA、釓特酸葡胺)，由于這類Gd螯合物為小分子物質，在機體中代謝很快，為了達到肉眼可辨識的成像效果，需要加大造影劑的使用劑量，從而增加Gd離子泄露導致的風險(如腎纖維化)，特別是對于腎功能不全的患者更要慎用。研究[7-8]表明，相比于傳統小分子造影劑，納米造影劑在機體滯留時間較長，可以降低造影劑的使用劑量，易于功能化修飾，提高磁共振成像效果,因此眾多研究人員大力開發納米尺度(1～100 nm)造影劑。

造影劑本身不能產生造影信號，而是借助本身的磁學性質，通過與水分子的相互作用，間接改變病變部位與正常部位的氫質子的弛豫時間，使兩者差別化更為明顯，改變其信號強度，從而增強病變部位的圖像對比度。Gd3+最外層有七個單電子，具有最強的偶磁矩，因而成為MRI造影劑的主要研究對象[9-10]。

介孔SiO2具有較高的比表面積、穩定介孔孔道、可調節的納米尺度、較高的藥物負載能力、易于表面修飾和良好生物兼容性等特點，氧化硅納米材料的商用產品已廣泛應用于臨床，因而，介孔SiO2被廣泛用于生物醫藥的研究[11-12]。Taylor et al[13]將Gd組裝到介孔SiO2介孔晶體材料(mesoporous crystalline material，MCM)MCM-41的孔道當中，利用介孔SiO2多孔的結構特點，使釓離子與孔道內的水分子充分接觸，改變周圍水質子的翻轉時間，提高縱向弛豫率。

本研究參考相關文獻，選擇相對尺寸適中，合成穩定的介孔SiO2合成方法[14]，先合成出直徑大小為30 nm左右，具有2 nm左右的孔道結構，以此介孔SiO2納米粒子為內核，在反應混合溶液中，先加入GdCl3·6H2O，在堿性條件下(混合溶液的pH為9.0)，先形成氫氧化釓包覆于介孔SiO2的表面，再加入TEOS，將Gd2O3束縛于SiO2表層，烘干后又經過高溫煅燒，除去有機模板，氫氧化釓脫水變成Gd2O3，形成Gd2O3鑲嵌在介孔SiO2的表面。通過SiO2的多孔結構束縛水分子，延長水分子的滯留時間，增加Gd2O3與水分子的接觸時間，提高造影效果，本實驗合成和機制詮釋圖見圖8。

圖8 SG0.1的合成及機制詮釋

介孔SiO2的比表面積越大，其所能束縛水分子的能力越強，自由通過孔道進入的水分子也就越多，因而，表面Gd2O3接觸的水分子數量和時間也就越長[10]。通過探討5個梯度的GdCl3·6H2O添加量，顯示在添加量為0.1 g時，獲得的產物比表面積最大，孔道結構明顯。以SG0.1作為研究對象，并進一步對SG0.1的結構進行表征，檢測其MRI造影性能、穩定性以及生物相容性。

本研究表明，SG0.1作為新型MRI造影劑，具有穩定均一的納米結構，優良的對酸穩定性能，極佳的造影性能和生物兼容性，為未來潛在的臨床應用提供堅實依據。