肝細胞生長因子活化JAK2/STAT3通路促進巨噬細胞M1型向M2型極化

顧奕玥，胡澤平，王云飛，周 青，汪 淵

肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)是一種多功能生長因子，與其特異性受體(c-Met)結合后，通過激活相關信號通路在調節炎癥免疫等方面發揮重要功能[1]。動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是由炎癥介導的慢性血管疾病，AS斑塊中，巨噬細胞通過分泌大量促炎因子，使AS斑塊趨于不穩定[2-3]。研究[4]表明，AS斑塊中的巨噬細胞因局部微環境的變化，可分化為經典活化促炎的M1型和替代活化抗炎M2型。在不穩定斑塊的脂質核心M1型大量存在，促進AS進展；在穩定型斑塊中M2型數量較高，促進斑塊穩定。調控M1型巨噬細胞向M2型極化已成為抗AS治療的重要靶點。HGF和受體c-Met廣泛存在于心血管系統中，具有很強的抗炎作用。本課題組前期進行的動物實驗和體外細胞實驗[5]結果表明：HGF促進M2表型標志物精氨酸酶Ⅰ(Arg Ⅰ)的表達，抑制M1表型標志物一氧化氮合酶(iNOS)的表達，促進斑塊穩定、抑制AS進展；HGF可能促進巨噬細胞M1型向M2型轉化，但其具體分子機制并不明確。近年來研究[6-7]顯示，信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)，作為HGF/c-Met軸的下游效應因子，與M2型巨噬細胞極化和抗炎因子產生密切相關。該研究旨在探討HGF是否通過JAK2/STAT3信號通路促進巨噬細胞M1型向M2型極化。

1 材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑RAW264.7細胞株為小鼠來源的巨噬細胞株，由中國科學技術大學生命科學院贈送。HGF、干擾素-γ(interferon-γ, IFN-γ)購自美國Peprotech公司；細菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)購自美國Sigma公司；DMEM(高糖)培養基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；Janus激酶2(JAK2)特異性抑制劑AG490購自美國Med Chem Express公司；iNOS、白細胞介素-6(IL-6)、Arg Ⅰ、白細胞介素-10(IL-10)、JAK2、STAT3、P-STAT3、β-actin抗體購自美國Sant Cruz Biotechnology公司；P-JAK2抗體購自美國abcam公司；二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Griess reagents試劑盒購自上海碧云天公司。

1.2 主要儀器和設備無菌細胞操作臺(蘇凈安泰公司)；CO2/O2三氣水套式細胞培養箱、低溫離心機(Thermo Scientific，美國)；酶標儀(1510，Thermo Scientific，美國)；電泳儀、垂直電泳槽(北京六一儀器廠)；制冰機(SCOTSMAN)。

1.3 方法

1.3.1細胞培養和傳代 37 ℃水溫復蘇RAW264.7細胞，用DMEM(高糖)完全培養基(10%胎牛血清、100 μg/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素)，將細胞瓶置入飽和濕度37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每48 h更換培養基1次，待細胞長至80%～90%，用0.25%胰酶進行消化傳代，用于以下實驗。

1.3.2細胞誘導和分組 未極化的RAW264.7巨噬細胞為M0對照組；IFN-γ(20 ng/ml)和LPS(500 ng/ml)誘導RAW264.7巨噬細胞(M0型)12 h，使M0巨噬細胞極化呈M1型[8-9]，為M1組。不同濃度的HGF(5、10、20 ng/ml)干預巨噬細胞M1型12 h，為5M1組、10M1組、20M1組；50 μmol/L AG490和10 ng/ml HGF共同干預巨噬細胞M1型12 h，為AG490+10M1組。

1.3.3CCK8檢測法 取沖懸的RAW264.7巨噬細胞，按200 μl/孔(2×103個細胞)種于96孔板內，按1.3.1細胞培養方法，培養至細胞貼壁后，換用無血清培養基繼續培養12 h，然后分別給予0、0.1、0.5、2.5、5、10、15、20 ng/ml濃度HGF干預12 h。每孔加入10 μl的CCK8試劑，37 ℃、5% CO2培養箱孵育4 h后，在酶標儀上，450 nm處檢測各孔吸光度值。

1.3.4培養上清液亞硝酸鹽濃度(NO%)的測定 分別收集M0、M1、5M1、10M1、20M1組細胞培養上清液。使用Griess reagents試劑盒檢測各組培養上清中亞硝酸鹽的分泌。使用全自動酶標儀在540 nm處讀取吸光度值。

1.3.5Western blot法檢測蛋白表達 上述方法分組處理好巨噬細胞后，用4 ℃的PBS清洗3次，每孔加入150 μl蛋白裂解液，靜置冰上30 min，充分裂解后刮取細胞蛋白存于1.5 ml EP管中反復凍融3次，4 ℃、14 000 r/min離心30 min棄除上清液，用BCA法進行蛋白定量。配制SDS-PAGE凝膠，各組等量蛋白上樣、電泳分離，電泳后將蛋白轉移至PVDF膜上。室溫下5%脫脂牛奶封閉PVDF膜2 h，分別用TBST、TBS清洗PVDF膜一次，相應的一抗(1 ∶1 000)孵膜，4 ℃過夜。TBST洗膜3次后用TBS洗膜1次，每次10 min。室溫孵育二抗(1 ∶5 000)2 h，TBST洗膜3次后用TBS洗膜1次，ChemiQ4600mini化學發光成像系統顯影，β-actin為內參，用 Quantity One系統進行灰度值分析。

1.4 統計學處理采用SPSS 16.0、GraphPad Prism 5軟件進行數據統計分析，組間比較采用SNK-Q檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HGF對RAW264.7巨噬細胞增殖的影響用濃度在0～20 ng/ml之間的HGF預處理巨噬細胞12 h，與M0對照組比較，HGF對RAW264.7巨噬細胞無增殖作用(F=1.868,P=0.13)。選用HGF(5、10、20 ng/ml)進行后續實驗。

2.2 HGF對M1型巨噬細胞培養上清液亞硝酸鹽濃度的影響與M0對照組比較，M1組培養上清液亞硝酸鹽濃度明顯升高(F=7.129,P<0.05)。與M1組比較，各干預組培養上清液亞硝酸鹽濃度較干預前明顯下降(F=5.705,P<0.05)，見圖1。

圖1 HGF對巨噬細胞M1型培養上清液亞硝酸鹽濃度的影響

1：M0對照組；2：M1組；3：5M1組；4：10M1組；5：20M1組；與M0組比較：*P<0.05；與M1組比較：#P<0.05

2.3 HGF對M1型巨噬細胞M1、M2表型標志物蛋白表達的影響與M0對照組比較，M1組巨噬細胞M1表型標志物iNOS、IL-6蛋白表達顯著增加(F=3.326、316.529，P<0.05),見圖2A；M1組巨噬細胞M2表型標志物Arg Ⅰ、IL-10蛋白表達明顯減少(F=22.515、33.832，P<0.05),見圖2B。與M1組比較，不同濃度HGF干預巨噬細胞M1型12 h后，各干預組M1表型標志物iNOS、IL-6蛋白表達呈劑量依賴性減少(F=284.711、568.634，P<0.05)，見圖2A；各干預組M2表型標志物Arg Ⅰ、IL-10蛋白表達呈劑量依賴性增加(F=431.018、1.302，P<0.05)，見圖2B。

圖2 HGF對M1型巨噬細胞M1和M2表型標志物蛋白表達的影響

2.4 HGF對JAK2/STAT3信號通路的影響與M0對照組比較，M1組JAK2/STAT3通路相關蛋白JAK2、STAT3磷酸化水平較低(F=6.283、30.863，P<0.05)，見圖3；與M1組比較，不同濃度HGF干預M1巨噬細胞后，各干預組JAK2、STAT3磷酸化水平明顯增強，呈劑量依賴性(F=130.709、22.480，P<0.05)，見圖3。使用JAK2特異性阻斷劑AG490 50 μmol/L與10 ng/ml HGF干預巨噬細胞M1型12 h后，與10M1組比較，AG490+10M1組M2表型相關蛋白Arg Ⅰ表達水平明顯下降(F=299.75，P<0.05)，見圖4。

3 討論

HGF最初因其在肝臟再生中的促分裂作用被發現和研究。這種多功能生長因子由間質細胞分泌，與其特異性受體c-Met結合后，通過激活相關信號通路在細胞增殖、運動與遷移、抗凋亡、抗纖維化和調節炎癥免疫等方面發揮重要的功能。近年來研究[10]表明，HGF與受體c-Met結合，可促進缺血心肌血管新生，并調節多種細胞信號轉導通路，發揮其復雜多效的抗AS作用。

圖3 HGF對JAK2/STAT3信號通路的影響

1：M0對照組；2：M1組；3：5M1組；4：10M1組；5：20M1組；與M0組比較：*P<0.05；與M1組比較：#P<0.05

圖4 JAK2/STAT3通路被抑制后M2型相關蛋白表達

1：M0對照組；2：M1組；3：10M1組；4：AG490+10M1組；與M0比較：*P<0.05；與M1比較：#P<0.05；與10M1比較：△P<0.05

AS是一種慢性炎癥性疾病，AS斑塊中，巨噬細胞通過吞噬氧化的低密度脂蛋白(ox-LDL)形成泡沫細胞，并分泌大量促炎因子，導致斑塊脂質核心增大，使AS斑塊趨于不穩定。AS斑塊中的巨噬細胞，根據局部微環境的差異，可進一步分化成不同的細胞亞型。并且，隨著微環境的變化，不同的細胞亞型之間，可以相互轉化，即為極化可塑性。目前，研究比較明確的巨噬細胞亞型包括經典活化促炎的M1型和替代活化抗炎M2型。在動脈粥樣斑塊中，M1型巨噬細胞增多時，生成和釋放促炎性因子(iNOS、IL-6等)，使斑塊穩定性下降易于破裂，導致血栓形成，造成心血管事件的發生；當M2型巨噬細胞增多時，分泌IL-10、轉化生長因子-β(TGF-β)等抑炎因子，可使斑塊纖維帽增厚，增加斑塊的穩定性。因此，誘導M1型巨噬細胞向M2型極化可以抑制斑塊進展，促進斑塊穩定。調控巨噬細胞極性可能成為臨床治療以AS為病理基礎的心血管疾病的新策略。

本研究中，LPS和IFN-γ誘導的M1型巨噬細胞高度表達M1表型標志物iNOS、IL-6，并大量分泌亞硝酸鹽。經HGF干預后，M1表型標志物iNOS、IL-6的表達和培養上清中亞硝酸鹽的釋放明顯降低，M2表型標志物Arg Ⅰ、IL-10的表達明顯增加。這些結果表明HGF促進M1向 M2表型極化。

JAK2是一種蛋白酪氨酸激酶，STAT3作為JAK2的直接底物，存在于細胞質中并調節相關靶基因的表達[11-12]。JAK2對STAT3的磷酸化，促進STAT3的核轉位，并激活M2巨噬細胞相關抗炎因子IL-10、Arg-1的表達[13-14]。M2型巨噬細胞中，STAT3信號通路的激活程度，遠高于M1型巨噬細胞。有研究[15]表明，HGF/c-Met可激活下游效應因子STAT3，調節免疫應答。本研究顯示，與M0對照組或M1組相比，HGF干預LPS和IFN-γ誘導的M1型巨噬細胞后，可以顯著活化JAK2/STAT3信號通路。通過在HGF干預的M1型巨噬細胞中加入JAK2特異性阻斷劑，發現LPS和IFN-γ誘導的RAW264.7巨噬細胞(M1型)M2表型相關蛋白Arg I表達明顯降低。這表明抑制JAK2可阻斷HGF促進M2型巨噬細胞極化和產生抗炎因子Arg I的能力。這些結果表明，HGF促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化的分子機制可能與活化JAK2/STAT3信號通路相關。

體內大部分巨噬細胞在復雜的微環境中是處于M1型和M2型之間的某個狀態。HGF促進M1向M2表型極化，調節了M1/M2型巨噬細胞分化的比例，可能成為治療AS的新靶點。但HGF調控M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞極化，是否還涉及其他分子機制，有待進一步深入研究。