LukS-PV對乳腺癌細胞MAD-MB-231增殖、凋亡及細胞周期的影響

于文偉，許良飛，汪自然，強雅雯，馬筱玲

在女性中，乳腺癌是最常見的腫瘤類型，也是世界上第二大常見的腫瘤[1]。三陰乳腺癌(triple-negative breast cancer,TNBC)約占所有乳腺癌病例的10%～15%，它的病理特征是缺乏雌激素、孕激素和人類表皮生長因子三種受體[2]。由于TNBC惡性程度高,并且缺乏靶向治療藥物，導致其預后較差。目前臨床的治療手段有手術切除、化療、放療、靶向治療及免疫治療，但是臨床療效不佳。所以急需新的有效并毒副作用小的靶向藥物。

PV-殺白細胞素(panton-valentine leucocidin,PVL)是由金黃色葡萄球菌分泌，PVL含有S組分(LukS-PV)和F組分(LukF-PV)兩種亞組分，課題組前期研究[3]表明LukS-PV能夠在體內外誘導白血病細胞凋亡，且體內實驗表明并沒有明顯的毒副作用，進一步研究顯示LukS-PV是通過補體C5a的受體(C5a receptor, C5aR)發揮促凋亡作用[4]，結合C5aR在TNBC中高表達的文獻報道[5]，由此可推測LukS-PV能夠與高表達C5aR的TNBC細胞結合，發揮抗腫瘤效應。該研究采用TNBC細胞株MAD-MB-231研究LukS-PV對細胞增殖、細胞周期和凋亡的影響，為其臨床應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑MAD-MB-231購自中科院上海細胞庫；DMEM高糖培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自南美Gemini公司；CCK-8試劑盒、胰酶、青-鏈霉素、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術公司；周期試劑盒、凋亡試劑盒購自美國BD公司；B淋巴細胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)、Bcl-2相關的X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3 (cysteine aspartic acid specific protease-3, Caspase-3)、Caspase-8、β-actin一抗購自美國CST公司；二抗購自武漢愛博太泰克生物科技公司；大腸桿菌BL21(DE3)重組表達載體pET28a-LukS-PV由本課題組構建并在-80 ℃冰箱保存。

1.2 儀器與設備超凈工作臺購自北京亞太科隆設備有限公司；倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；細胞培養箱、多功能酶標儀購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司；流式細胞儀購自美國BD公司；凝膠成像儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 細胞培養MDA-MB-231細胞培養于含有10%的胎牛血清、1%鏈霉素和青霉素的高糖DMEM培養基中，放置在5% CO2、37 ℃培養箱中培養。在細胞生長至80%左右融合度時，用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline, PBS)洗滌2次，加入1 ml胰酶直到細胞形態變圓，加入2 ml含10%血清的DMEM培養基，用槍頭輕輕吹打混勻并按適宜比例進行傳代。

圖1 不同濃度LukS-PV對MAD-MB-231細胞形態學影響 ×200

1.4 LukS-PV的表達、純化及定量按照常文嬌 等[6]報道的方法對LukS-PV的表達、純化，用BCA法檢測蛋白濃度。

1.5 CCK-8檢測細胞增殖細胞生長至對數生長期后，用胰酶消化并接種于96孔細胞培養板，每孔4×103個細胞，每組3個復孔，24 h后加入對應濃度的LukS-PV, 繼續培養，分別在刺激后12、24、36 h每孔加入10 μl CCK-8溶液，繼續培養4 h后，在450 nm波長下檢測吸光度(optical density, OD)值。細胞增殖抑制率的計算方法為：增殖抑制率(%)=1-OD(實驗組-空白組)/OD(對照組-空白組)×100%。

1.6 Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡細胞生長至對數生長期后，用胰蛋白酶消化并混勻，以每孔2×105個細胞的濃度接種于6孔板中，培養1 h待細胞貼壁后，加入相應濃度的LukS-PV, 繼續培養24 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌2次，加入400 μl Annexin V 結合液重懸細胞，在避光條件下加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI,避光室溫孵育15 min, 上機檢測。

1.7 流式細胞儀檢測細胞周期當細胞在對數生長期后，用胰蛋白酶消化并混勻，以每孔2×105個細胞的密度鋪于6孔板中，培養12 h待細胞貼壁后，加入相應濃度的LukS-PV, 繼續培養24 h，用胰蛋白酶消化細胞，1 000 r/min離心5 min，收集細胞，用PBS洗滌2次，在4 ℃條件下用70%乙醇過夜固定，并用PBS洗滌2次，加入0.5 ml的PI/RNase staining染液，避光室溫孵育30 min，上機檢測。

1.8 蛋白印記檢測凋亡相關蛋白的表達LukS-PV刺激細胞24 h后，收集細胞，PBS洗滌2次，加入適量細胞蛋白提取試劑，冰上搖動30 min,用BCA法檢測蛋白濃度。用12%或15%的SDS-PAGE膠進行電泳，轉移至NC膜，結束后用5%的脫脂牛奶封閉2 h，分別放入以1 ∶1 000倍稀釋的對應一抗，4 ℃孵育過夜，用PBST洗滌3次，每次10 min，然后放入以1 ∶10 000稀釋的二抗中室溫孵育1.5 h，結束后用PBST洗滌3次，每次10 min，最后加入發光液，并在凝膠成像系統中進行曝光。

2 結果

2.1 LukS-PV對MAD-MB-231形態學影響LukS-PV刺激MAD-MB-231細胞24 h后，顯微鏡下觀察，PBS組細胞呈貼壁生長，形態清晰，大小均一，而隨著LukS-PV濃度增加，細胞數量變少，細胞間隙增加，細胞變圓，懸浮細胞數量增多。見圖1。

2.2 LukS-PV對MAD-MB-231增殖的影響用不同濃度的LukS-PV作用MAD-MB-231細胞12、24、36 h后，采用CCK-8法檢測LukS-PV對MAD-MB-231增殖抑制率，結果表明，隨著LukS-PV濃度的增加，對細胞增殖的抑制率越高，且對細胞的增殖抑制率隨著作用時間延長而增加，表明LukS-PV對MAD-MB-231增殖的抑制作用是濃度-時間依賴性的。見圖2。

圖2 不同濃度LukS-PV對MAD-MB-231增殖的抑制作用

2.3 LukS-PV對MAD-MB-231細胞周期的影響用流式細胞儀檢測細胞周期變化。在不同濃度的LukS-PV作用MAD-MB-231細胞36 h后，結果顯示，細胞周期被阻滯在G1/G0期，且LukS-PV的濃度越高，阻滯在G1/G0期細胞越多(F=130.1，P<0.05)。見圖3、表1。

圖3 不同濃度LukS-PV對MAD-MB-231細胞周期分布的影響

圖4 不同濃度LukS-PV對MAD-MB-231細胞凋亡的影響

表1 LukS-PV對MAD-MB-231細胞周期變化的影響

與 PBS組比較：*P<0.05

2.4 LukS-PV對MAD-MB-231細胞凋亡的影響不同濃度LukS-PV刺激MAD-MB-231細胞24 h后，流式結果顯示，不同濃度LukS-PV(0.25、0.5、0.75、1 μmol/L)作用24 h后，凋亡率分別為(10.63±1.24)%、(16.45±1.49)%、(29.19±3.45)%、(58.10±2.15)%，與PBS組(5.40±1.15)%相比，LukS-PV能誘導MAD-MB-231細胞凋亡，呈濃度依賴性(F=298,P<0.05)。見圖4。

2.5 LukS-PV對MAD-MB-231細胞凋亡相關蛋白表達的影響隨著LukS-PV濃度增加，Bax、Cleved-caspase3、Cleved-caspase8表達增加，Bcl-2表達減少。見圖5。

圖5 不同濃度LukS-PV對凋亡相關蛋白表達的影響

3 討論

TNBC由于惡性程度高，缺乏有效的靶向治療藥物，導致患者預后較差，因此尋找高效低毒的靶向治療藥物是研究的熱點。細菌毒素兼具與靶細胞結合的特異性與細胞毒性，能夠靶向結合并殺傷靶細胞，起到抗腫瘤作用。研究[7-8]表明一些細菌毒素有很好的抗腫瘤效應，其中部分已用于臨床治療，例如，肉毒桿菌分泌的神經毒素，對前列腺癌、乳腺癌、神經母細胞癌具有良好的抑制作用，目前已經臨床3期試驗。白喉桿菌產生的白喉毒素對膠質瘤、宮頸癌、乳腺癌有很好的抗癌作用，目前已經進入臨床2期試驗[9-10]，另外，綠膿假單胞菌產生的外毒素和李斯特菌產生的溶血素[11]也顯示了很好的抗癌作用。這表明細菌毒素具有廣闊的應用前景。

本文研究的細菌毒素LukS-PV是金黃色葡萄球菌分泌的殺白細胞素PVL的雙組分之一(LukS-PV和LukF-PV)，結果表明LukS-PV能夠抑制MAD-MB-231增殖，使其周期阻滯在G0/G1期，研究結果與前期在白血病中研究[12]結果一致。細胞凋亡是細胞程序性細胞死亡，并且誘導癌細胞凋亡在抗腫瘤治療中有重要意義，也是評價抗腫瘤藥物藥效的一個重要方面。本研究顯示LukS-PV能夠濃度依賴性誘導MAD-MB-231凋亡。線粒體途徑、內質網途徑和死亡受體途徑是凋亡的三條主要通路[13]。Bcl-2家族在線粒體凋亡通路中扮演者關鍵作用，課題組通過檢測線粒體凋亡通路相關蛋白顯示，LukS-PV能夠上調Bax、Cleved-caspase3、Cleved-caspase8表達增加，下調Bcl-2表達，說明LukS-PV可能是通過激活線粒體通路而誘導MAD-MB-231凋亡。

課題組前期實驗[4]表明LukS-PV是通過C5aR發揮抗白血病作用，近年研究[5]顯示，C5aR在TNBC中的陽性率約為40%，且C5aR在癌旁組織中不表達，C5aR的高表達與腫瘤的大小、腫瘤分期呈正相關性，與5年生存率呈負相關性。所以根據以上研究，LukS-PV未來可能作為C5aR陽性的TNBC的靶向治療藥物。