促紅細胞生成素衍生肽對急性心肌梗死大鼠炎癥和Erk1/2表達的影響

王世祥，王 斌，郭國鋒，許 衛，陳永權，陳晞明

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是心血管疾病患者最常見的死因之一[1]。而尋找能有效減輕AMI后炎癥反應且副作用少的藥物是下一步研究方向。促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)是一種由腎臟和肝臟分泌的糖蛋白激素，能促進紅細胞生成，也有抗炎、抗凋亡等對組織器官的保護作用[2]。然而，有研究[3]顯示，一次性輸注大量EPO會過度刺激體內骨髓造血系統，增加心血管系統的高凝狀態甚至血栓形成。近年有學者研究[4]合成促紅細胞生成素衍生肽(helix B surface peptide，HBSP)，一種EPO衍生而來的螺旋B表面肽，既保留EPO的組織保護作用，具有抗氧化、抑制炎癥、減少細胞凋亡的作用，同時也可以減少其副作用。因此，該文以HBSP治療AMI模型大鼠，探討HBSP對AMI心肌炎癥的影響和機制，為梗死后心肌保護尋找新的治療方案。

1 材料與方法

1.1 材料HBSP購自上海科肽生物科技有限公司；白介素6(interleukin-6，IL-6)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；兔抗細胞外調節蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2, Erk1/2)、兔抗磷酸化細胞外信號調節激酶1/2(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase1/2,p-Erk1/2)、鼠抗GAPDH購自北京康為世紀生物科技有限公司；羊抗兔二抗和驢抗鼠二抗購自武漢博士德生物工程公司；組織裂解液購自杭州弗德生物科技有限公司；聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate, BCA)蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術研究所；牛血清白蛋白(albumin from bovine serum，BSA)粉末購自廣州斯佳生物公司；免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；POWERLAB多導生理記錄儀、心臟彩超機購自美國PHILIPS公司。

1.2 動物采用8周齡SD雄性SPF級大鼠，體質量180～200 g，將30只大鼠隨機分成3組：sham組(10只)、AMI組(10只)、HBSP治療組(10只)。所有大鼠由中山大學實驗動物中心提供(合格證號：44008500006902)，并飼養于恒溫20～26 ℃、恒濕40%～70%、潔凈度7、低噪、無菌的南方醫科大學實驗動物中心。

1.3 方法

1.3.1AMI模型構建和給藥 以Olivetti方法結扎冠狀動脈左前降支的手術方法以構建大鼠AMI模型，觀察多導生理記錄儀上的標準導聯II，若見ST段弓背樣抬高和(或)T波抬高或降低，大鼠周圍肌肉組織出現顏色蒼白或變暗，則提示建模成功。sham組大鼠在左前降支留置松結。HBSP組在結扎左前降支術后立即予HBSP工作液(90 μg/kg)[5]腹腔注射，sham組和AMI組予等量生理鹽水腹腔注射。術后24 h動物實驗大鼠全部存活，處死進行后續處理。實驗符合動物倫理管理委員會要求。

1.3.2大鼠心肌組織IL-6、TNF-α測定 建模24 h后，取結扎線以下左心室心肌，將心肌組織研磨，組織裂解液裂解細胞，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液，采用IL-6和TNF-α ELISA試劑盒檢測心肌組織IL-6和TNF-α含量。

1.3.3Western blot法檢測p-Erk1/2、Erk1/2蛋白的表達 建模24 h后，取結扎線以下左心室心肌，將心肌組織研磨，提取心肌組織蛋白，制成蛋白樣品，上樣后置于電泳緩沖液中電泳，分離目的蛋白，電轉120 min，5% BSA封閉1 h后，p-Erk1/2(1 ∶1 000)、Erk1/2(1 ∶1 000)和GAPDH(1 ∶4 000)一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，羊抗兔二抗(1 ∶15 000)或驢抗鼠二抗(1 ∶15 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL顯色，曝光掃描，分析光密度。

1.3.4免疫組化檢測Erk1/2蛋白的表達 石蠟包埋、切片(4 μm)，經二甲苯、不同濃度酒精脫蠟，蒸餾水浸泡，微波抗原修復，室溫冷卻后，過氧化氫、3% BSA封閉，滴加Erk1/2兔抗多克隆抗體(1 ∶200)孵育過夜，滴加二抗免疫組化試劑，DAB顯色，蒸餾水終止顯色，蘇木精染核5 min，蒸餾水沖洗，脫水透明，中性樹脂封片，鏡下隨機取6個視野(×200)，拍照，采用IPP 6.0軟件統計陽性細胞。

1.3.5超聲心動圖檢查 24 h后，所有大鼠行超聲心動圖檢查，在處死前，予以10%水合氯醛腹腔注射麻醉、備皮，應用超聲心動圖機(ie33型號；美國PHILIPS公司)及7.5 MHz高頻線控探頭(美國PHILIPS公司)行心臟彩超檢測，檢測左室后壁收縮期厚度(left ventricular posterior wall systolic thickness，LVPWS)、收縮期室間隔厚度(systolic septal thickness，IVSs)、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness，LVPWd)、室間隔厚度(interventricular septal thickness，IVSd)、左心室射血分數(left ventricular ejection fraction，LVEF)指標。

2 結果

2.1 HBSP減少AMI大鼠心肌組織中IL-6、TNF-α的表達與sham組比較，AMI組大鼠心肌組織IL-6和TNF-α蛋白表達顯著增加；而HBSP組大鼠心肌組織IL-6和TNF-α蛋白表達均較AMI組明顯降低(P=0.000)，表明HBSP可緩解急性心肌梗死的心肌的炎癥。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織炎癥因子的表達情況

A：IL-6的表達情況；B：TNF-α的表達情況；與sham組比較：*P<0.05 ；與AMI組比較：#P<0.05

2.2 HBSP抑制AMI大鼠心肌組織Erk1/2通路

2.2.1Western blot檢測各組大鼠心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2蛋白表達的變化 Western blot檢測結果顯示，與sham組比較，AMI組心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2蛋白表達，以及p-Erk1/2與Erk1/2比值顯著增加；而HBSP組心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2蛋白表達，以及p-Erk1/2與Erk1/2比值則明顯低于AMI組(P=0.001)。見圖2。

2.2.2TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡結果 Sham組極少陽性表達細胞；AMI組可見大量棕黃色細胞；HBSP組可見部分棕黃色細胞。見圖3。

圖2 各組大鼠心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2的表達情況

與sham組比較：*P<0.05 ；與AMI組比較：#P<0.05

圖3 各組大鼠心肌組織TUNEL染色情況 ×200

2.2.3免疫組化檢測各組大鼠心肌組織Erk1/2蛋白表達情況 免疫組化結果顯示與sham組比較，AMI組心肌組織中Erk1/2蛋白表達顯著增加；而HBSP組心肌組織中Erk1/2蛋白表達明顯低于AMI組(P=0.001)。見圖4。

2.3 HBSP對AMI大鼠心功能的影響AMI組心功能指標顯著低于sham組，而HBSP治療組心功能指標明顯高于AMI模型組(P=0.001)。見圖5、表1。手術建模后24 h，行心臟超聲檢查，sham組與AMI組大鼠比較， AMI組LVPWs、IVSs、 LVPWd、IVSd顯著升高、LVEF降低(P<0.05)。表明AMI組大鼠發生心肌重構，心肌肥厚。建模24 h后，在相同條件下，HBSP組與AMI組 LVPWs、IVSs、 LVPWd、IVSd顯著降低,LVEF顯著升高(P<0.05)。表明HBSP能夠減少心肌損傷，保護心功能。

圖4 各組大鼠心肌組織Erk1/2的表達情況

與sham組比較：*P<0.05 ；與AMI組比較：#P<0.05

表1 處死前各組超聲心動圖各指標比較

與sham組比較：*P<0.05 ；與AMI組比較：#P<0.05

3 討論

HBSP是EPO衍生而來的表面肽[6]，具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等作用。近幾年，越來越多學者通過基礎實驗和動物實驗證明HBSP對細胞、組織器官(如心臟、腎臟、神經等)有重要的保護作用[5]，本研究證明了HBSP可以減輕炎癥反應和下調Erk1/2的表達。通過抑制Erk1/2信號通路，減少IL-6和TNF-α的表達，同時抑制STAT3和Bcl-2的表達，從而減輕心肌梗死中心肌組織的炎癥、凋亡和心肌受損。這為尋找保護心肌提供新的藥物選擇。

圖5 三組大鼠心臟彩超情況

AMI是冠狀動脈急性、持續性缺血低氧導致心肌細胞受損、壞死、凋亡、炎癥的過程，該過程伴有心肌酶活性的增高、心電圖進行性改變及心功能的改變。其中，心臟彩超是評價心功能的重要輔助檢查。本文通過心臟彩超檢查心功能。結果發現，HBSP可減少心肌受損。Erk1/2是絲裂原活化蛋白激酶的一個亞族。Erk1/2信號轉導通路與細胞生長、分化、凋亡、炎癥反應等密切相關[7]。既往文獻[8-9]報道，p-Erk1/2信號通路可調控細胞增殖、凋亡、炎癥活動。p-Erk1/2從細胞質進入細胞核作用于核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、轉錄激活因子等轉錄因子，后者進一步調節靶基因的轉錄，其中NF-κB可調節各種炎癥因子及炎癥介質，NF-κB的激活可引起炎癥級聯反應，進而調節多種促炎癥的細胞因子，如TNF-α、IL-6；同時TNF-α亦可激活Erk1/2從而放大炎癥反應[10-12]。有研究[13-15]顯示，Erk1/2可通過NF-κB促進炎癥細胞因子TNF-α的轉錄，后者可激活Erk1/2從而形成惡性循環，進一步加強炎癥放大級聯反應。對于心血管方面，活化的Erk1/2 信號通路在冠心病致心肌炎癥反應及心功能損傷過程中發揮了重要作用，并提出抑制ERK1/2 信號轉導通路可能成為冠心病致心肌炎癥反應防治的潛在新靶點[16]。本研究通過體內動物實驗顯示，HBSP降低心肌組織炎癥因子TNF-α和IL-6的含量，減少AMI大鼠心肌組織p-Erk1/2和Erk1/2的表達。此結果提示，HBSP可通過抑制Erk1/2的表達減少炎癥因子TNF-α和IL-6以及心肌損傷標志物的釋放。