人參皂苷CK抑制內質網應激防治酒精性肝損傷

張 宇，王洪波，朱振宇，任 輝，蒙 軒，劉振文

酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是長期大量飲酒導致的第二大肝臟疾病，臨床表現為脂肪肝、酒精性肝炎、肝硬化、肝細胞壞死等，其嚴重危害人民的身體健康[1]。近年來不斷有研究表明內質網應激(endoplasmic reticulum stress, ERS)對于諸多肝臟相關疾病，尤其在ALD的發生發展中發揮作用。研究[2]顯示ERS可以打破肝臟內脂質穩態平衡，誘發肝細胞凋亡與脂變。人參皂苷CK是人參皂苷在體內發揮活性的主要形式，具有保護肝臟、抗炎、改善免疫功能、抗癌等藥理活性[3-4]。該研究基于建立大鼠酒精性肝臟損傷模型，從ERS反應性角度研究人參皂苷CK對肝臟病理變化、細胞凋亡、超微結構、脂質合成的影響，以期通過ALD發病機制尋找合適的抗酒精性肝病靶點藥物，對于有效預防和治療ALD有重要的理論和臨床意義。

1 材料與方法

1.1 動物及主要試劑

1.1.1動物 雄性SD大鼠，SPF級，體質量280～300 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.1.2主要試劑 蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒購自江蘇碧云天生物科技；GRP78抗體、GAPDH抗體購自英國劍橋abcam公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自江蘇凱基生物；蘇丹Ⅳ染色液購自北京雷根生物技術有限公司；人參皂苷CK(ZT-20093)購自上海甄準生物公司；甘油三酯檢測試劑盒購自德國達姆施塔特sigma公司；注射用腺苷蛋氨酸購自德國基諾藥廠。

1.2 方法

1.2.1大鼠酒精性肝損傷動物模型的建立 將雄性SD大鼠10只作為對照組，剩余40只參考Wen et al[5]造模方法并加以改進，每日予以56°白酒(10 ml/kg)、玉米油(2 ml/kg)、吡唑(25 mg/kg)混合物灌胃1次，每周腹腔注射0.3 ml/kg四氯化碳、橄欖油混合液(體積比1 ∶3)1次，連續10周，判斷酒精性肝損傷動物模型造模成功[6]。第11周起將造模大鼠隨機分為模型組和低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預組，高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組，腺苷蛋氨酸陽性對照組(200 mg/kg)，采用腹腔注射給藥方式，每天1次，連續給藥2周，對照均采用同體積生理鹽水。然后處死，分離肝臟，分離原代細胞或肝臟標本-70 ℃凍存。

1.2.2HE染色病理學檢測 取各組肝臟組織，100 g/L甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm切片。切片常規用二甲苯脫蠟，經無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、75%乙醇脫水，每次各5 min，蒸餾水洗3次。染色后脫水透明，封固、光鏡觀察炎癥壞死等病變程度。

1.2.3Western blot檢測GRP78表達 取各組肝臟組織，RIPA細胞蛋白裂解液提取蛋白，二喹啉甲酸法(BCA法)蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳后PVDF膜恒流濕法進行轉膜。轉膜成功的PVDF膜轉移到5%脫脂奶粉-TBST封閉液于室溫封閉l h。再將PVDF膜分別加入稀釋的GRP78、GADPH一抗(1 ∶2 000稀釋)，4 ℃輕搖過夜；隨后加入相應的二抗(1 ∶1 000 稀釋)，37 ℃恒溫搖床孵育l h。蛋白的相對表達量用待測蛋白與GADPH的灰度值比值計算。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測肝細胞凋亡 收集各組新鮮肝組織剪碎，置于100目銅網上輕搓，生理鹽水沖洗，2 500 r/min離心棄去上清及細胞碎片，收集細胞懸液。參照《Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒》通過流式細胞儀進行分析。

1.2.5電鏡觀察各組肝細胞超微結構 分離各組肝臟原代細胞，2.5%戊二醛固定，反應4 h；0.1 mmol/L磷酸緩沖液清洗3次；30%、50%、70%、85%、95%乙醇梯度脫水各一次，每次20 min；100%乙醇脫水2次，每次20 min；乙酸異戊酯置換2次，每次20 min；將細胞均勻涂布蓋玻片上，-70 ℃冷凍12 h；冷凍干燥48 h；將蓋玻片樣品噴金粉后上樣，觀察。

1.2.6甘油三酯含量檢測 使用甘油三酯檢測試劑盒，甘油三脂總濃度通過偶聯酶促反應生成有色產物，在波長570 nm下檢測，其顏色深淺程度與樣品中甘油三酯的含量成正比。

2 結果

2.1 人參皂苷CK干預對酒精性肝損傷大鼠肝臟組織病理的影響HE染色病理學檢測結果顯示正常大鼠肝臟組織結構清晰完整，肝血竇腔隙正常，肝細胞索結構明顯，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射性排列。模型組大鼠肝臟組織肝細胞索界限不清晰，肝細胞質呈現一定程度的空泡結構；肝小葉中央靜脈周圍區域集中可見點狀或灶狀壞死變性，壞死區域存在大量侵潤炎癥細胞；肝細胞可見脂肪變性結構, 內含大小不等的脂滴。低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預組肝細胞基本恢復正常，肝細胞索排列整齊，肝竇基本恢復正常，肝細胞濁腫明顯減輕，部分肝細胞處于氣球樣變。高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組與腺苷蛋氨酸陽性對照組肝小葉結構清晰，肝索、肝竇無明顯異常，細胞漿著色均勻，無明顯變性，細胞核結構較清晰，體積正常，但核質略少，或分布不均，可見少量散在的肝細胞有輕度濁腫。見圖1。

2.2 人參皂苷CK干預抑制酒精性肝損傷大鼠肝臟ERS反應Western blot檢測各組肝臟組織ERS標志蛋白GRP78，結果顯示模型組GRP78蛋白表達量相對于對照組明顯升高，表明酒精刺激后的大鼠肝臟發生了ERS。低濃度(20 mg/kg)和高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預后均不同程度降低GRP78蛋白表達，其中高濃度(40 mg/kg)組GRP78表達接近正常組和腺苷蛋氨酸陽性對照組。表明人參皂苷CK干預可有效抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的ERS反應。見圖2。

圖1 各組大鼠肝臟組織病理變化×200

A：正常組；B：模型組；C：低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預組；D：高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組；E：腺苷蛋氨酸陽性對照組

圖2 Western blot檢測酒精性肝損傷ERS標志蛋白GRP78蛋白表達

1：正常組；2：模型組；3：低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預組；4：高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組；5：腺苷蛋氨酸陽性對照組

2.3 人參皂苷CK干預抑制酒精性肝損傷大鼠肝細胞凋亡Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測肝細胞凋亡，結果顯示正常組、模型組、低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預組、高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組、腺苷蛋氨酸陽性對照組細胞總凋亡率分別為(10.23±0.98)、(24.01±1.76)、(13.66±0.65)、(11.04±0.88)、(9.92±0.71)。經單因素方差分析，組間差異有統計學意義(F=90.95，P<0.05)。模型組較正常組細胞凋亡率顯著升高，高濃度(40 mg/kg)干預組較模型組均顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖3。表明人參皂苷CK干預可有效抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的細胞凋亡。

2.4 人參皂苷CK干預改善酒精性肝損傷大鼠肝細胞超微結構電鏡觀察各組肝細胞超微結構結果顯示，較正常組肝細胞，模型組細胞形態異常，細胞內線粒體數量明顯減少，線粒體增大，線粒體嵴結構紊亂，時有線粒體嵴結構消失呈空泡樣改變；低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預組肝細胞線粒體略有恢復，但基質仍舊稀??；高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組細胞形態及線粒體結構明顯改善，可見大量線粒體，呈橢圓形，線粒體嵴結構整齊，同正常組及腺苷蛋氨酸陽性對照組，見圖4。

2.5 人參皂苷CK干預對酒精性肝損傷大鼠肝臟脂質合成代謝的影響檢測肝細胞內甘油三酯含量結果顯示，正常組、模型組、低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預組、高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組、腺苷蛋氨酸陽性對照組細胞甘油三酯含量分別為(24.76±1.53)、(38.25±1.97)、(31.15±1.77)、(28.81±1.21)、(27.64±1.36)。經單因素方差分析，組間差異有統計學意義(F=30.71，P<0.05)。模型組較正常組顯著升高，高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組較模型組顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。表明人參皂苷CK干預可有效抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的肝細胞脂肪病變程度。

圖3 流式檢測酒精性肝損傷細胞凋亡

A:正常組；B：模型組；C：低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預組；D：高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組；E：腺苷蛋氨酸陽性對照組

圖4 電鏡檢測酒精性肝損傷細胞超微結構×100 000

A：正常組；B：模型組；C：低濃度(20 mg/kg)人參皂苷CK干預組；D：高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預組；E：腺苷蛋氨酸陽性對照組

3 討論

酒精性肝病作為長期以來主要肝臟疾病和研究重點，其發病機制復雜，除了酒精毒性削弱正常肝細胞的代謝及肝細胞膜的穩定性、損傷線粒體功能等[7-8]，越來越多學者開始關注ERS及其介導的肝細胞凋亡可能在其中發揮的重要作用。如Yan et al[9]通過建立大鼠酒精性肝病模型，電鏡下觀察到模型組大鼠肝細胞的線粒體明顯受損，出現膜斷裂，嵴斷裂或消失，與對照組相比，模型組大鼠肝臟線粒體滲透轉運通道PTP開放,導致線粒體腫脹，540 nm處吸收光度值A540減少(P<0.01)，模型組線粒體跨膜電位顯著降低且模型組線粒體質量有明顯損害，胞內鈣離子顯著增加，表明長期飲酒可引起肝細胞線粒體PTP開放，Ca2+外流，跨膜電位下降甚至崩潰，導致線粒體腫脹，引發肝細胞的凋亡或損傷。關慧[10]通過乙醇處理HepG2細胞建立酒精性肝損體外模型，結果表明乙醇組GRP78基因表達水平明顯升高，細胞內甘油三酯含量增多，蛋白酶體活性降低，差異有統計學意義。

內質網是機體蛋白質合成、運輸的主要場所，同時參與脂質代謝的合成。當某些因素使細胞內質網生理功能發生紊亂，未折疊及錯誤折疊的蛋白質增多，在內質網腔內堆積，會引起ERS。ERS進而通過激活未折疊蛋白反應信號傳導通路提高細胞生存能力[11-12]。其中，GRP78作為內質網內駐留最多的分子伴侶，當ERS發生、內質網內未折疊蛋白增多時，GRP78可與未折疊蛋白結合并幫助其正確折疊，因此GRP78被認為是ERS發生的標志性分子[13]。本研究顯示，大鼠肝臟在造模后GRP78蛋白表達量相對于對照組均顯著升高，表明酒精刺激后的大鼠肝臟發生了明顯的ERS反應。此外，針對酒精性肝損傷模型組，病理結果顯示肝細胞索界限不清晰，肝小葉中央靜脈周圍區域集中可見點狀或灶狀壞死變性，壞死區域存在大量侵潤炎癥細胞；流式結果顯示促進細胞凋亡；電鏡觀察結果顯示細胞形態異常，細胞內線粒體數量明顯減少，線粒體增大，線粒體嵴結構紊亂，時有線粒體嵴結構消失呈空泡樣改變；甘油三酯含量增加；均和上述研究理論及成果一致。

人參皂苷CK是天然二醇型人參皂苷在人體內主要降解產物，是其發揮活性作用的主要形式，諸多研究[14]表明人參皂苷CK具有保護肝臟、抗炎、改善免疫功能、抗癌等藥理活性。如張雷明 等[15]用四氯化碳致大鼠慢性肝損傷模型，發現人參皂苷CK可以有效降低血清轉氨酶ALT、AST水平，顯著增加血清SOD的含量，表明CK對慢性肝損傷具有一定的保護作用，其作用可能與抗氧化有關。本研究顯示高濃度(40 mg/kg)人參皂苷CK干預可以明顯改善酒精性肝損傷大鼠肝臟組織病理病變，顯著降低肝損傷引起的GRP78蛋白表達量上調，抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的ERS反應。人參皂苷CK干預可有效抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的細胞凋亡及線粒體結構損傷，可見線粒體嵴結構整齊，形態正常。此外，有報道ERS可通過激活固醇調節元件結合蛋白促進甘油三酯合成增多[16]，所以在該實驗中選取甘油三酯含量的測定作為ERS下游效應的評估。結果表明人參皂苷CK干預明顯改善細胞脂肪變性情況，可明顯降低甘油三酯含量。

綜上所述，本研究進一步證實ERS與酒精性肝病的關系，并且首次證明人參皂苷CK可抑制ERS，并在一定程度上防治酒精性肝病。人參皂苷CK干預可以明顯改善酒精性肝損傷大鼠肝臟組織病理病變，抑制ERS反應，抑制酒精刺激大鼠肝臟引起的細胞凋亡及線粒體結構損傷，抑制脂肪病變程度。這為深入研究酒精性肝病損傷的發病機制，為臨床尋找理想的抗肝損傷藥物具有重要意義。