EGCG對致齲變異鏈球菌抑制作用的研究

施秀芳，劉 雨，楊椋昕，王一君，張 晨，王烈成，王元銀

齲病是在以細菌為主的多因素作用下牙體硬組織發生的病變。變異鏈球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)、乳桿菌、放線菌等為常見的致齲菌，其中S.mutans的致齲性主要依賴于其產酸、耐酸及黏附性能。綠茶的主要成分是茶多酚，而茶多酚主要是由兒茶素組成的。兒茶素組分中含量最多的是表兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)[1]。研究[2]證實EGCG在保護神經系統、抗氧化及抑菌等方面起重要作用。該課題組通過觀察S.mutans與EGCG在厭氧條件下的共同孵育情況，得出EGCG對S.mutans的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，并檢測不同濃度的EGCG對S.mutans的光密度(optical density，OD)值、PH值及黏附能力的影響，從而探究綠茶提取物EGCG對致齲S.mutans的抑菌作用。

1 材料與方法

1.1 材料國際標準變異鏈球菌菌株ATCC 25175(血清型c)、牛腦心浸出液培養基(brain heart infusion，BHI)購自北京陸橋公司；EGCG購自北京Solarbio公司；蔗糖購自美國Sigma公司；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，成分為2 mmol/L KH2PO4、2.7 mmol/L KCl、10 mmol/L Na2HPO4、137 mmol/L NaCl等。

1.2 方法

1.2.1液體二倍稀釋法測定MIC值 取8支試管編號1～8，1號試管中加入9 ml 100 mg/L的EGCG藥液，2～7號試管中各加入4.5 ml的BHI液體培養基，根據二倍稀釋法，1號試管中EGCG的濃度為100 mg/L、2號為50 mg/L、3號為25 mg/L、4號為12.5 mg/L、5號為6.25 mg/L、6號為3.125 mg/L。隨后1～7號試管中分別加入0.5 ml的菌液，將7號試管中加入的液體作為陰性對照，空白對照為8號試管中加入的5 ml BHI液體培養基。紫外分光光度計在590 nm波長下測孵育前(0 h)及37 ℃厭氧箱孵育24 h時各試管中S.mutans的OD值，計算24 h該菌的OD增長值，即ΔOD。肉眼觀察厭氧孵育24 h時8支試管中該菌的生長情況，以溶液澄清的最小濃度EGCG為EGCG對S.mutans的MIC。

1.2.2不同濃度的EGCG作用下S.mutans的生長變化 依照測定的MIC，1～5號試管中各加入4.5 ml含EGCG的BHI液體培養基，其中1號試管中EGCG的濃度為2 MIC，其余濃度依次減半。6號及7號試管中分別為4.5 ml、5 ml不含EGCG的BHI液體培養基，1～6號試管中各加入0.5 ml菌液。7支試管均置于37 ℃厭氧箱孵育，孵育前(0 h)及孵育4、8、12、24、48 h時，在590 nm波長下用紫外分光光度計測各試管中S.mutans的OD值，實驗重復3次。根據3次實驗所測OD值的均值，繪制出不同濃度的EGCG作用下S.mutans的生長曲線。

1.2.3不同濃度的EGCG作用下S.mutans的產酸變化 1～5號試管中各加入4.5 ml含EGCG的BHI培養基(均含1%蔗糖)，其中1號試管中EGCG的濃度為2 MIC，其余濃度依次減半。6號、7號分別加入4.5 ml和5 ml的不含EGCG的BHI培養基(含1%蔗糖)，1～6號各加入0.5 ml的菌液，7支試管均置于37 ℃厭氧箱孵育。孵育前(0 h)及孵育4、8、12、24、48 h時取樣本，離心后收集上清液，pH計檢測上清液pH值并記錄，實驗重復3次。根據3次實驗所測pH值的均值，繪制出S.mutans的pH變化曲線。

1.2.4不同濃度的EGCG作用下S.mutans的黏附能力變化 1～4號試管中各加入4.5 ml含EGCG的BHI培養基(均含1%蔗糖)，其中1號試管中EGCG的濃度為1 MIC，其余濃度依次減半。5號試管中加入4.5 ml不含EGCG的BHI培養基(含1%蔗糖)。1～5號試管中各加入0.5 ml菌液，然后將5支試管傾斜30°置于37 ℃厭氧箱孵育。孵育24 h后取出，試管內液體均倒入第2批相應編號的試管中，原試管中各加入5 ml PBS液，輕輕震蕩洗滌，將洗滌液移至第3批相應編號的試管中；原試管中再次各加5 ml PBS液，然后刮下原試管壁上的全部細菌；將第2、3批試管中的溶液進行離心,棄上清液，然后向第2、3批試管中各加5 ml PBS液。充分混勻后在590 nm下測三批試管中S.mutans的OD值，實驗重復3次，三批試管對應的均值分別記為A、B、C。通過均值計算不同濃度的EGCG作用下S.mutans的黏附率和黏附抑制率變化，計算公式如下：

黏附率=A/(A+B+C)×100%；黏附抑制率(%) =(對照組黏附率-實驗組黏附率)/對照組黏附率×100%。

1.3 統計學處理采用SPSS 16.0軟件進行統計分析，多組間均值兩兩比較采用單因素方差分析的LSD檢驗，顯著水平α=0.05。

2 結果

2.1 EGCG對S.mutans的MIC8號空白對照組溶液為澄清的淡黃色，7號陰性對照組溶液為渾濁的淡黃色，1～5號與8號相似，6號與7號相似。以溶液澄清的最小EGCG濃度為EGCG對S.mutans的MIC，則5號6.25 mg/L的EGCG即為對S.mutans的MIC。計算S.mutans在不同濃度EGCG藥液中孵育24 h時的OD增長值，即ΔOD，可見隨著濃度的增加，其ΔOD值減少，見表1。為了進一步驗證MIC值，采用瓊脂稀釋法測EGCG對S.mutans的MIC，S.mutans的生長受到80%以上的抑制時，EGCG的最低濃度即為MIC。得出的結論與液體二倍稀釋法一致，即6.25 mg/L為EGCG對S.mutans的MIC。

表1 不同濃度EGCG抑制S.mutans的ΔOD值

2.2 EGCG對S.mutans生長的影響EGCG濃度為1/2 MIC時即可在共孵育的各時間段均能抑制S.mutans的生長，差異有統計學意義(4 h：F=17.918，P=0.013；8 h：F=319.461，P<0.01；12 h：F=241.725，P<0.01；24 h：F=2 038.812，P<0.01；48 h：F=3 835.226，P<0.01)，隨著藥液濃度的增高，對該菌生長的抑制作用逐漸增強。見圖1。

圖1 不同濃度的EGCG對S.mutans生長曲線的影響

與菌液組比較：*P<0.05，**P<0.01

2.3 EGCG對S.mutans產酸的影響EGCG濃度為1/4 MIC時即可在各時間段抑制S.mutans的產酸能力，差異有統計學意義(4 h：F=120.032，P<0.001；8 h：F=37.020，P=0.004；12 h：F=102.400，P=0.001；24 h：F=317.793，P<0.001；48 h：F=92.571，P=0.001)，隨著EGCG藥液濃度的增高，對該菌產酸能力的抑制作用逐漸增強。見圖2。

圖2 不同濃度的EGCG對S.mutans產酸變化的影響

與菌液組比較：**P<0.01

2.4 EGCG對S.mutans黏附能力的影響EGCG濃度為1/4 MIC時與菌液組相比黏附率降低，差異有統計學意義(F=98.195，P=0.001)，且隨著EGCG濃度的增加，黏附率逐漸降低，黏附抑制率逐漸增加。見表2。

表2 不同濃度的EGCG對S.mutans黏附的影響

黏附率：各實驗組與菌液組比較；抑制率：低濃度組EGCG與相鄰高濃度組比較

3 討論

齲病是人類常見的口腔疾病，是在具有產酸及耐酸性能的乳酸桿菌、S.mutans等作用下分解、破壞牙體硬組織所造成的[3]。細菌致齲的先決條件是菌群以特異性或非特異性的方式黏附于牙面，相互聚集形成菌斑生物膜。S.mutans是世界上公認的主要致齲菌之一，其能夠利用生物膜中的多糖提高牙菌斑中酸的含量[4]。研究[5]表明，與低糖或無糖相比，高糖濃度下S.mutans的產酸、耐酸、黏附毒力更強，由此推測，隨著糖濃度的提高，S.mutans的致齲能力逐漸增強[6]。

綠茶有著幾千年的飲用歷史，具有防癌、降血脂、抑菌等多種功效。綠茶的主要化學成分包括茶多酚、蛋白質、糖類、生物堿和氨基酸等[7]。研究[8]證實茶多酚具有抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌等多種功能。也有研究[9]報道，茶多酚與木糖醇聯合應用可明顯抑制菌斑的形成。國內研究[10]表明茶多酚對細菌的抑制作用主要表現為對細菌細胞壁的破壞。而國外研究[11]顯示茶多酚主要是通過破壞細菌的細胞膜從而抑制細菌的生長、繁殖。茶多酚主要由兒茶素類化合物組成，研究[12]證實兒茶素類化合物能抑制S.mutans的產酸能力。已知EGCG是兒茶素類化合物中含量最高、最具生物活性的成分[13]，具有最強的抗感染潛能以抑制各種微生物的生長及生物膜的形成[14]。但EGCG對致齲S.mutans的抑制作用及具體機制仍待研究。

為探討EGCG對S.mutans的抑菌效能，本研究利用二倍稀釋法檢測EGCG對該菌的MIC，將不同濃度的EGCG與該菌共孵育，利用紫外分光光度計測590 nm波長下各濃度EGCG藥液中該菌的OD值，pH計測該菌產酸的pH值，并利用OD值評估該菌的黏附性能。該研究結果表明，EGCG對S.mutans的MIC為6.25 mg/L，EGCG濃度為1/2 MIC時即可在共孵育的各時間段抑制該菌的生長，EGCG濃度為1/4 MIC時即可抑制S.mutans的產酸能力且與菌液組相比黏附率降低；隨著EGCG濃度的增加，S.mutans的OD值逐漸降低，pH值逐漸上調，黏附率逐漸降低。鑒于EGCG對S.mutans的抑制作用，其可能在齲病的防治領域有重要作用，為齲病的防治提供了新方向。但本研究尚缺乏在體實驗的支持，進行在體實驗的關鍵是齲齒模型的建立。該課題組采用4～5周齡的雄性SD大鼠，喂養高糖食物并隔天涂抹S.mutans菌液，以期3～4個月的時間導致齲齒從而建立SD大鼠的齲齒模型。但由于SD大鼠本身不易患齲齒且長期喂養存在不可控性的死亡等，多次造模均未成功。接下來課題組將改進造模方案，爭取造出齲齒模型，用在體實驗進一步研究EGCG對齲病的影響。