白藜蘆醇通過SIRT1/FoxO1路徑改善大鼠腦缺血/再灌注損傷機制研究

曹自為，李傳文，劉學春，管葉明，汪青松

全球每年約有1 500萬人罹患卒中，其中因此而死亡約500萬人，是人類僅次于心臟疾病的死亡病因。盡管理論上有很多種途徑來治療卒中，可實際臨床中都以失敗而告終。阿替普酶溶栓治療是缺血性卒中唯一由衛生部門批準的急性藥物治療[1]。但是由于其具有溶栓時間窗窄(<4.5 h)、篩選條件嚴格、再發出血等弊端，使其在臨床實際工作中未能廣泛使用。因此積極尋找一種治療缺血性卒中的有效藥物，成為未來缺血性卒中的研究方向。

沉默信息調節因子1(silent information regulator protein,SIRT1)屬于煙酰腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+)依賴的類組蛋白去乙酰化酶，廣泛存在人類各組織細胞中。SIRT1通過去乙酰化調節下游通路，作用于細胞的分化、衰老、凋亡和代謝[2]。而白藜蘆醇(resveratrol，RES)是主要存在于葡萄表皮、桑葚以及日常生活中常見的花生等多種中藥及食物中的一種多酚類化合物，具有預防腫瘤、抑制炎癥、改善循環、抗老年動脈粥樣硬化及抑制細胞增殖等生物學活性。現有研究[3]證明，RES可作為SIRT1的激動劑，并在缺血性腦損傷中扮演著重要角色。SIRT1/插頭盒蛋白O1(forkhead box O1 protein,FoxO1)通路在改善肝臟損傷、調節脂肪細胞代謝、改善胰島功能等方面發揮著重要作用，然而對SIRT1/FoxO1 與腦缺血/再灌注(cerebral ischemia-reperfusion,CIR)損傷之間的關系尚未明了。該實驗選擇大鼠大腦中動脈栓塞模型，腹腔注入SIRT1激動劑RES及SIRT1抑制劑(selisistat,EX-527)，通過觀察SIRT1、FoxO1，以及炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-1β和抗凋亡因子B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白表達的影響，探討白藜蘆醇SIRT1/FoxO1路徑改善大鼠腦CIR損傷的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器EX527購自美國Selleck公司；RES購自上海金和生物技術有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自美國Sigma 公司；山羊抗兔IL-1β、山羊抗兔SIRT1、山羊抗兔 Bcl-2購自北京Bioss公司；兔抗TNF-α購自美國 Bioworld 公司；逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcriotion-polymerase chainreaction，RT-PCR)的TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒(RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit)購自美國Thermo公司。圖片灰度值分析及凝膠成像系統購自北京科創銳新生物有限公司。

1.2 實驗動物及分組選擇普通級健康雄性SD大鼠40只，體質量250～300 g ，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，安徽醫科大學實驗動物中心飼養，采用干濕分離飼養籠，自然光照，自由進食，7 d后實驗。實驗前所有大鼠隨機分為4組: 假手術(Sham)組、模型(CIR)組、白藜蘆醇(RES)組、白藜蘆醇(RES)+EX527組，每組10只。

1.3 鼠大腦中動脈梗塞模型建立Sham組大鼠僅單純分離血管，其余三組采用改良線栓法[4]構建大鼠右側大腦中動脈栓塞模型。使用10%濃度的水合氯醛，按照0.3 ml/100 g的劑量腹腔麻醉大鼠，仰臥固定于木板上。選擇正中切口，分離出右側頸總動脈(common carotid artery,CCA)、頸內動脈(internal carotid artery,ICA)、頸外動脈(external carotid artery,ECA),夾閉CCA、ECA，于ECA近端用眼科剪留一小口，用頭端被指甲油涂抹的魚線經ECA插入ICA,深度約20 mm,當感覺有阻力時結扎插入孔，松開CCA、ICA。缺血1 h后拔出線栓，再灌注24 h。術中及術后用暖光燈照射大鼠肛門部，保持動物體溫(37±0.5)℃。在整個實驗階段內出現死亡、昏迷及抽搐的大鼠均被棄去。模型成功的標準: 從尾部將大鼠提起，保持懸空，轉頸超過10°，左前肢屈曲內收，同時伴肌張力下降，活動時呈典型追尾征，若無上述典型癥狀予以剔除。本實驗參照上述標準選取30只大鼠。RES和EX527溶于5% DMSO，RES組分別于手術前5 d、3 d、1 d按照100 mg /kg經腹腔注入白藜蘆醇;RES+EX527組除白藜蘆醇以外，EX527遵照相同時間點按5 mg /kg經腹腔注入。

1.4 神經功能缺損評分除Sham組外，采用改良神經損傷嚴重程度評分(modified Neurological Severity Scores,mNSS)量表[5]分別對其余三組于 1、3、7、14 d各時間點對其進行神經功能缺損評分，共18分，分別以1～6分、7～12分、13～18分作為神經功能缺損輕度、中度、重度的劃分標準。

1.5 RT-PCR檢測梗死灶周邊組織SIRT1、FoxO1、TNF-α、IL-1β、Bcl-2 mRNA的表達取梗死灶周邊缺血腦組織50～100 mg，剪碎，液氮研磨，在4 ℃環境下分別加入1 ml TRIzol、氯仿、異丙醇、DEPC水后離心，制備目的細胞總RNA，置于EP管中，并以該RNA為模板，在適當引物的存在下，由反轉錄酶生成cDNA。取出cDNA作為熒光定量的模板，經歷40次熱循環，擴增后收集熒光信號，采用相對量化研究分析數值，計算方法為2-ΔΔCt，見表1。

1.6 Western blot 法檢測梗死灶周邊組織SIRT1、FoxO1、TNF-α、IL-1β、Bcl-2的表達取梗死灶周邊腦組織約100 mg，加入RIPA細胞裂解液1 ml(內含1 mmol PMSF)進行裂解。4 ℃、12 000 r/min離心15 min。收集含有組織總蛋白上清液，經12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至硝酸纖維膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液室溫封閉2 h。加入一抗后4 ℃緩慢搖動孵育過夜，洗滌后用辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2 h，再洗滌，使用ECL發光試劑盒來檢測蛋白，以 β-actin 為內參，北京科創銳新生物凝膠成像系統的分析系統進行膠片條帶的分析。

2 結果

2.1 各時間點mNSS評分比較Sham組在各時間點評分均為0分。第1天的評分無明顯差異，RES組較CIR組與RES+EX527組稍有降低，差異有統計學意義(F=4.196，P<0.05)；在第3、7、14天，與CIR組和RES+EX527組比,RES組評分明顯降低，差異有統計學意義(F=8.318、9.483、14.596，P<0.01)，見表2。

2.2 梗死灶周邊腦組織SIRT1、FoxO1、TNF-α、IL-1β、Bcl-2 mRNA的表達RES組FoxO1、TNF-α、IL-1β mRNA 均低于CIR組和RES+EX527組(P<0.01),RES組SIRT1、Bcl-2 mRNA表達量高于CIR組和RES+EX527組(F=141.160、62.750、35.77、96.046、63.401，P<0.01),見圖1。

表1 RT-PCR引物序列及產物片段

表2 各組不同時間段神經功能缺損評分比較

與CIR組比較：**P<0.01；與RES+EX527組比較：##P<0.01

圖1 梗死灶周邊腦組織SIRT1、FoxO1、TNF-α、IL-1β、Bcl-2 mRNA的表達

與Sham組比較：**P<0.01；與RES+EX527組比較：##P<0.01

2.3 梗死灶周邊腦組織SIRT1、FoxO1、TNF-α、IL-1β、Bcl-2蛋白的表達RES組FoxO1、TNF-α、IL-1β蛋白表達均低于CIR組和RES+EX-527組(P<0.01),RES組SIRT1、Bcl-2 蛋白表達量高于CIR組和RES+EX527組(F=71.739、107.335、66.291、42.346、401.454，P<0.01),見圖2。

圖2 Western blot法檢測各組大鼠腦組織梗死灶周邊SIRT1、FoxO1、IL-1β、TNF-α、Bcl-2蛋白的表達

與Sham組比較：**P<0.01；與RES+EX527組比較：##P<0.01

3 討論

CIR損傷是缺血性腦血管病的主要病理生理過程，可通過炎性因子激活、細胞氧化、內皮細胞破壞、激活凋亡、線粒體損傷等導致神經細胞損傷及死亡[5]。其中炎癥反應和細胞凋亡在損傷中扮演著重要的角色，也是臨床治療的關鍵點。本實驗從抗炎和抗凋亡兩個角度出發探究RES改善腦CIR損傷具體機制。

RES作為多種植物中含有的多酚類有機物，最早是發現其在心臟方面的保護作用。多年來，流行病學研究[6]表明，由于RES含量高，適量攝入葡萄酒，特別是紅葡萄酒，可降低患心血管疾病的風險。除心臟保護作用外，最近幾十年RES作為腦保護劑，也逐漸受到人們的重視。SIRT1作為抗衰老酶家族的一員，在成人腦中普遍存在，其中海馬、丘腦、皮質和下丘腦中表達水平很高。研究[3]表明，SIRT1可能與神經發育、學習與記憶、代謝調節、神經保護有關。RES可通過激活SIRT1通路，乙酰化核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)的Re-1A/p65亞單位，抑制NF-κB的核轉錄，減輕大鼠腦組織缺血/再灌注后的炎性損傷。同時也有研究[7]顯示，大鼠蛛網膜下腔出血的早期腦損傷中，RES可以通過SIRT1通路改善功能失調的血腦屏障通透性來降低腦組織水腫，同時乙酰化P53抑制調亡。其中又有研究[8]證明RES改善血腦屏障的機制可能與激活SIRT1后抑制金屬蛋白酶-9和環氧合酶-2的表達有關。以上研究說明RES可通過SIRT1通路改善大腦神經功能。

FoxO1是O-box子家族中叉頭轉錄因子的成員,其余還有FoxO-3，-4和-6。FoxO1活性受乙酰化、磷酸化和泛素化調節[9]。林超 等[10]研究證明活性FoxO1存在于細胞核中，當受SIRT1的脫乙酰化酶作用后向細胞質轉移。1.5 kb的大鼠SIRT1啟動子區域含有一個假定的叉頭狀(forkhead-like,FKHD-L)結合位點，它與FKHD共有元件(TTGTTTAC)在八個堿基中的五個基序上反向排列，并且一組五個胰島素響應性核心重復基序，FoxO1通過與這些結合元件的結合直接激活SIRT1轉錄。FoxO1反過來又通過SIRT1介導的脫乙酰化調節其轉錄活性，從而形成了SIRT1的自反饋通路[11]。同時也有研究[12]證明RES通過FoxO1通路，抑制TNF-α、IL-1β水平，提高Bcl-2等因子的表達，減輕敗血癥誘導的肝損傷。因此推測RES改善CIR損傷可能SIRT1/FoxO1通路相關。

本研究顯示RES組大鼠缺血灶周邊組織無論是SIRT1的蛋白表達或是轉錄活性都較CIR組及Sham組提高。RES組炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達較Sham組和CIR組減低，RES組抗凋亡因子Bcl-2的表達較Sham組和CIR組上升，同時相對應的神經功能評分提高，但是這些效應可被SIRT1特異性抑制劑EX527所阻斷。本實驗中作為SIRT1的激動劑，RES刺激了SIRT1的表達，而同等情況下FoxO1的表達確有著相反的結局。

綜上所述，本研究證實，RES可以通過SIRT1-FoxO1通路降低炎癥因子TNF-α、IL-1β和促進抗凋亡因子Bcl-2的釋放，從而改善大鼠CIR損傷。