ZFX在肝內膽管癌中的表達及臨床意義

林 群，劉付寶，余孝俊，謝 坤，趙義軍

肝內膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是原發性肝癌中的第二常見的惡性腫瘤，其發病率在世界范圍內差異比較大，其中東南亞最高，西方國家發病率偏低，并且逐年上升[1-2]。ICC發生可能是一個多因素過程，缺乏明確的風險因素，長期存在的如肝內膽管結石、肝膽吸蟲侵染、膽道囊腫、原發性硬化性膽管炎等被認為是ICC的誘發因素[2]。由于其發病隱匿、淋巴轉移早、對放、化療不敏感、根治性手術切除率低等特點，大部分患者治療預后很差[3]。

X染色體耦聯鋅指蛋白(zinc-finger protein X-linked，ZFX)是在哺乳動物X染色體上編碼的轉錄因子。在細胞分化、胚胎及成人干細胞的自我更新中扮演著重要角色[4]。研究表明 ZFX不僅參與干細胞的自我更新，而且在結直腸癌[5]、肝細胞癌[6]、膽囊癌[7]、腎癌[8]等多種惡性腫瘤細胞中表達升高，但ZFX在ICC中的表達及其臨床意義國內外未見類似報道。該研究通過免疫組化技術檢測ZFX蛋白在ICC組織中的表達水平，并和癌旁組織及肝內膽管結石組織做比較，探討其與ICC患者臨床病理學特征和預后的關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性收集安徽醫科大學第一附屬醫院肝膽胰外科2012年2月～2017年2月行手術治療且臨床病歷資料完整的ICC患者的組織蠟塊，共選取60例ICC腫瘤組織、50例鄰近的癌旁正常膽管組織以及15例肝內膽管結石的膽管組織標本(經病理學檢測為無癌組織)。60例ICC患者均無全身遠處轉移，術前均未進行放療和化療，其中男38例，女22例；年齡34～76(56.5±9.4)歲；血清糖鏈抗原19-9(carbohydrate antigen19-9，CA19-9)≥37 ng/ml者34例，CA 19-9<37 ng/ml者26例；血清癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA) ≥5 ng/ml者20例，CEA<5 ng/ml者40例。TNM分期參考美國癌癥聯合委員會的標準，Ⅰ+Ⅱ期45例，Ⅲ+Ⅳ期15例。腫瘤低分化者29例，中高分化者31例。根據術前檢查、術中所見及術后淋巴結病理檢查，有淋巴結轉移者11例，無淋巴結轉移者49例。

1.2 主要試劑兔抗人ZFX多克隆抗體(bs-12306R，稀釋度1 ∶200)購自北京博奧森生物公司；PV-9001檢測試劑盒(兔二步法檢測試劑盒)及DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 實驗方法應用免疫組化方法檢測ICC組織、癌旁組織及正常肝內膽管結石組織中ZFX蛋白的表達。將病理科收集所得病例的石蠟包埋組織制作成厚度4 μm的切片。將所有的石蠟切片放入90 ℃的烤箱中烤片20 min，經二甲苯溶液浸泡3次各10 min脫蠟，在依次不同濃度乙醇(100%、95%、75%)溶液各5 min，蒸餾水水化，適量的內源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，抗原修復采用檸檬酸微波高火加熱10 min，加熱后冷卻1 min，在加熱1 min，反復5次，然后室溫自然冷卻30 min，孵育一抗兔抗人ZFX抗體4 ℃過夜，PBS洗3次，滴加增強酶標山羊抗兔IgG聚合物室溫20 min，PBS洗3次后DAB顯色，顯微鏡下控制，蘇木精復染，脫水，封片，最后鏡檢采集數據。用PBS代替一抗作為陰性對照。

圖1 膽管組織中ZFX的表達 PV×200

1.4 結果判定染色結果評估由對臨床病理資料不知情的兩位病理科醫師進行。應用普通光學顯微鏡在高倍鏡(×200)下隨機挑選5個視野，觀察陽性細胞染色程度和陽性細胞百分比，并進行評分。染色強度評分從0到3，依次為0(陰性，無色)，1(弱，淺黃色)，2(中，棕黃色)和3(強，棕褐色)； 陽性細胞百分比評分從0到4，依次為0(<5%)、1(≥5%～25%)、2(>25%～50%)、3(> 50%～75%)和4(>75%)。最終結果為兩項評分相加，總分≥ 3分認為是高表達，<3分認為是低表達[5]。

1.5 統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析。計數資料采用χ2檢驗，癌、癌旁及肝內膽管結石組織的ZFX表達比較采用配對t檢驗；采用Kaplan-Meier方法繪制ZFX高表達和低表達患者的生存曲線，并用Cox回歸分析模型確定ICC患者預后的獨立影響因素，檢驗水準α=0.05，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ZFX蛋白在三種組織中的表達免疫組化染色(PV-9001兔二步法檢測試劑盒)檢測三種組織中ZFX的表達，鏡下觀察可見ZFX蛋白表達主要定位在細胞核內，部分細胞質內可見表達，呈棕黃色染色顆粒，見圖1。結果表明ZFX蛋白在ICC組織、癌旁組織及肝內膽管結石組織中高表達率差異有統計學意義(χ2=18.662，P<0.001)，且腫瘤組織中的高表達率明顯高于癌旁組織(χ2=13.914，P<0.001)和正常肝內膽管結石組織(χ2=11.343，P=0.001)，差異有統計學意義，見表1。

2.2 ICC組織中ZFX蛋白表達與其臨床病理特征的關系ICC組織中ZFX的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小、血清CA19-9、有無脈管癌栓差異無統計學意義(P>0.05)；在血清 CEA升高、腫瘤分化程度低、有淋巴結轉移、 TNM分期高的患者ICC組織中ZFX高表達率較高，且在血清CEA、腫瘤分化程度的表達差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 三種膽管組織中ZFX的表達[n(%)]

表2 ZFX表達與ICC患者臨床病理特征的關系分析[n(%)]

2.3 ZFX蛋白表達與ICC生存預后的關系將有完整隨訪資料的46例ICC患者分為高表達組(31例)和低表達組(15例)，總體隨訪時間2～40個月，中位隨訪時間為12個月。結合免疫組化的結果，分析兩組總體生存率的差異，生存曲線見圖2，結果顯示ZFX高表達患者總體生存率明顯低于ZFX低表達患者，差異有統計學意義(P=0.006)。單因素Kaplan-Meier總體生存率分析結果表明淋巴結轉移、TNM分期以及ZFX表達與ICC患者預后顯著相關(P<0.05)，多因素Cox回歸模型分析結果表明ZFX表達是ICC患者不良預后的獨立影響因素(HR=2.635, 95%CI：1.044～6.651,P=0.040)，見表3。

圖2 ZFX高表達與低表達患者的生存曲線

因素HR95% CIP值單因素 年齡(≥60歲vs<60歲)1.0300.987～1.0740.173 性別(男vs女)1.1270.540～2.3530.750 腫瘤分化(中高分化vs低分化)1.1980.592～2.4240.616 淋巴結轉移(有vs無)2.7561.242～6.1150.013 TNM分期(Ⅰ/Ⅱ vs Ⅲ/Ⅳ)2.1491.025～4.5050.043 CA19-9(≥37 U/ml vs <37 U/ml)1.7410.816～3.7150.151 CEA(≥5 μl/L vs <5 μl/L)1.9130.925～3.9550.080 ZFX(高表達vs低表達)3.1651.290～7.7650.012多因素 淋巴結轉移(有vs無)2.0450.425～9.8330.372 TNM分期(Ⅰ/Ⅱ vs Ⅲ/Ⅳ)1.0630.246～4.5870.934 CEA(≥5 μl/L vs <5 μl/L)1.4640.695～3.0860.316 ZFX(高表達 vs 低表達)2.6351.044～6.6510.040

3 討論

ZFX屬于鋅指蛋白家族，由X染色體編碼，全長蛋白含有酸性轉錄激活域，核定位序列和由13 C2H2型鋅指組成的DNA結合域。研究[4,9]表明ZFX為胚胎干細胞和成人造血干細胞的共同轉錄調節因子，在胚胎和成人干細胞自我更新中發揮重要作用。另外對于成人造血干細胞功能長期穩定的維護，一定功能水平的ZFX是必須的。許多研究[10]表明ZFX不僅參與干細胞的自我更新，而且與多種惡性腫瘤的發生相關，可以促進腫瘤的增殖、轉移，影響癌癥患者預后。Weng et al[7]研究表明在膽囊癌組織中經常檢測到ZFX蛋白過表達，ZFX的表達與侵襲性臨床病理學顯著相關，并且導致膽囊癌患者的預后顯著較差，進一步通過體外細胞功能實驗，敲低ZFX的表達能顯著抑制膽囊癌細胞侵襲、增殖和轉移。Wu et al[11]研究證實了敲低ZFX基因的表達可通過下調細胞外信號調節激酶/絲裂原活化蛋白激酶通路在體外和體內抑制胃癌細胞增殖。

本研究通過免疫組化檢測60例ICC組織中ZFX的表達水平，結果顯示癌組織中ZFX表達明顯高于鄰近的癌旁組織(P<0.05)及肝內膽管結石組織(P<0.05)，這表明ZFX可能在ICC的發病機制中起重要作用。然后繼續分析ZFX表達與患者臨床病理特征的相關性，結果顯示在腫瘤組織分化低、TNM分期高、有淋巴結轉移及血清CEA升高的患者癌組織中ZFX高表達率較高。因此推測ZFX可能參與ICC的發生，過表達的ZFX可能促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。這也為腫瘤分子靶向治療提供新的作用位點。

在隨訪資料中，對ZFX基因表達水平與ICC患者的臨床預后意義進行研究，結果表明ZFX的表達與ICC生存預后顯著相關，高表達ZFX的ICC患者術后總體生存率較低。單因素生存分析結果表明有無淋巴結轉移、TNM不同分期以及ZFX表達高與低的ICC患者其生存時間差異有統計學意義，多因素Cox回歸模型分析結果表明ZFX可作為預測ICC患者預后不良的獨立因素，這一結果與ZFX在其他腫瘤中的隨訪結果類似。Li et al[8]報道了53例腎癌的臨床隨訪研究，結果表明ZFX預測較差的預后，可作為預后指標。Li et al[12]研究顯示ZFX可作為鼻咽癌患者的有效預后生物標志物，而且還表明針對ZFX的靶向治療可能是預防鼻咽癌進展和轉移的新型治療策略。

綜上所述，ZFX在ICC中常常表現為高表達，ZFX的表達可能參與肝內膽管的發生發展。高表達的ZFX與腫瘤惡性病理特征相關，是ICC不良預后的獨立因子。因此，ZFX可能成為ICC的潛在新型生物治療靶點，但具體的分子作用機制仍需進一步探索。