五參數流式積分系統在骨髓增生異常綜合征中的診斷價值

夏林歡，王會平，陶千山，郭進京，翟志敏

骨髓增生異常綜合征(myelodysplastic syndrome,MDS)是源于造血干細胞的髓系克隆性疾病，診斷上主要依靠骨髓細胞形態學和遺傳學異常改變[1-2]，當患者骨髓細胞學原始細胞增多、典型的病態造血或者特異性染色體異常存在時，MDS的診斷相對比較簡單明確，但仍有部分MDS患者缺乏特異性異常，導致臨床診療困難。流式免疫分型可以很清楚的分辨細胞的異常表達，在骨髓惡性腫瘤的定性和定量診斷上起著越來越重要的作用，已有很多報道免疫分型在MDS診斷中的潛在價值，并推出多種流式積分系統應用于MDS的診斷和鑒別診斷[3]，但要么所需抗體多，成本高，分析步驟繁雜不易臨床推廣，要么敏感性和特異性尚不夠理想，因此需要進一步摸索建立重現性和準確性好、簡單易操作的MDS流式檢測方法和診斷指標。

2009年Ogata et al[4]首次開展多中心實驗室研究MDS免疫表型特點并提出流式四參數積分系統，該研究結果初步提示用于診斷MDS方法快速簡單，成本低，特異性較好，但敏感度欠缺(敏感度30%～70%不等，特異度80%～90%以上[4])，所以尚需要更多的臨床研究予以證實或在此基礎上進行優化改良，本課題組前期研究[5]結果提示該積分系統對MDS的診斷有價值，但隨著樣本量的增加發現完全套用Ogata積分法誤診率較大，故在此基礎上根據MDS粒細胞免疫表型特點增補一個新的積分參數：粒細胞與淋巴細胞CD10平均熒光強度比值，建立五參數流式積分系統，并對改良后的流式積分系統的分析方法和在MDS中的診斷價值進行了研究。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性分析2015年1月～2017年10月于安徽醫科大學第二附屬醫院因外周血細胞減少行骨髓穿刺檢查患者骨髓流式參數(排除重復病例、血液系統惡性克隆性疾病、免疫分型資料不全以及臨床跟蹤失訪病例),共320例患者依照時間為節點，分為兩部分：研究組140例(用于五參數流式積分系統的建立)和驗證組180例(驗證該積分系統的臨床應用價值)。入選研究組病例初診時均診斷明確(MDS的診斷根據2014版國內MDS診療專家共識標準)，包括MDS患者34例(難治性貧血伴環形鐵粒幼紅細胞4例，難治性貧血伴單系病態造血2例，難治性貧血伴多系病態造血18例，難治性貧血伴原始細胞增多-1 8例，難治性貧血伴原始細胞增多-2 2例)，其中男20例，女14例，年齡18～86歲，中位年齡62歲，非MDS患者106例(再生障礙性貧血9例，缺鐵性貧血32例，免疫性血細胞減少41例，巨幼細胞性貧血18例，溶血性貧血6例)，其中男64例，女42例，年齡15～87歲，中位年齡57歲；驗證組初診時包括29例MDS患者，86例非MDS患者，65例血細胞減少原因待查患者，經過臨床至少6個月跟蹤隨訪，最終診斷MDS患者31例，其中男19例，女12例，年齡26～83歲，中位年齡65歲；非MDS患者149例，其中男60例，女89例，年齡12～87歲，中位年齡55歲。

1.2 骨髓標本處理骨髓標本2～5 ml經肝素抗凝，分別加入熒光素標記的CD34-FITC/CD19-PE/CD33-APC/CD45-PC7、CD10-FITC/CD45-PC7抗體組合，避光孵育，加入溶血素，磷酸緩沖鹽溶液洗滌，上機檢測[5]。流式細胞儀及抗體購自美國Beckman-Coulter公司。

1.3 設門

1.3.1CD34-FITC/CD19-PE/CD33-APC/CD45-PC7抗體組合的傳統四參數分析 所有細胞表達在前向角/側向角(FSC/SSC)散點圖上，設P1門去除細胞碎片及壞死細胞，代表全部有核細胞；P1門的細胞表達在CD34/CD45散點圖上，CD34+CD45dim的細胞，代表前體細胞群(P3門)；P3門的細胞表達在CD19/CD33散點圖上，CD34+CD19+CD33-的細胞代表B系前體細胞(P4門)，CD34+CD33+CD19-的細胞代表髓系前體細胞(P5門)；P1門中的細胞表達在CD45/SSC散點圖上，P6門代表淋巴細胞，P7門代表粒細胞；分別讀取髓系前體細胞與淋巴細胞的CD45平均熒光強度，淋巴細胞與粒細胞的側向角峰值。見圖1。

1.3.2CD10-FITC/CD45-PC7抗體組合的新參數分析 所有細胞表達在FSC/SSC散點圖上，設P1門代表全部有核細胞；P1門中的細胞表達在CD45/SSC散點圖上，P2門代表淋巴細胞，P3門代表粒細胞；同時將P1門的細胞表達在CD10/SSC散點圖上；分別讀取淋巴細胞與粒細胞的CD10平均熒光強度。見圖2。

1.4 分析參數計算下列5個參數，參數1：全部有核細胞中髓系前體細胞所占百分比；參數2：前體細胞中B系所占百分比；參數3：淋巴細胞與髓系前體細胞CD45平均熒光強度的比值；參數4：粒細胞與淋巴細胞側向角峰值的比值；參數5：粒細胞與淋巴細胞CD10平均熒光強度比值。流式分析軟件EXPO 32 MultiComp software購自美國Beckman-Coulter公司。數據分析者對病例的診斷和其他實驗室數據不知情。

1.5 統計學處理采用SPSS 19.0軟件進行分析，定量資料符合正態分布采用t檢驗，不符合正態分布采用秩和檢驗，定性資料采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。應用受試者工作特征(receiver operating characteristic curve,ROC)曲線分析曲線下面積(area under curve,AUC),設立cut-off值，確定診斷為MDS的參考值范圍。

2 結果

2.1 各參數統計學分析研究組內包括34例確診MDS患者和106例非MDS患者，兩組患者中年齡、性別分布差異無統計學意義。MDS患者與非MDS患者相比：① 參數1：髓系前體細胞占全部有核細胞比例明顯升高；② 參數2：前體細胞中B系比例明顯降低；③ 參數3：淋巴細胞和髓系前體細胞CD45平均熒光強度的比值未見明顯統計學差異，但均符合正態分布，這與Ogata積分系統結果一致，根據報道MDS患者CD45平均熒光強度與非克隆性血細胞減少患者相比分布有差異，比值高于或低于正常范圍之外[4]，設立參考值范圍為非MDS組均值±2個標準差(4.00±2×1.50)之外，即≤1.0或≥7.0；④ 參數4：粒細胞和淋巴細胞側向角峰值的比值明顯下降；⑤ 參數5：粒細胞和淋巴細胞CD10平均熒光強度的比值明顯下降。見表1。

圖1 CD34-FITC/CD19-PE/CD33-APC/CD45-PC7抗體組合的傳統四參數分析

A: FSC/SSC散點圖上顯示全部有核細胞(P1門)； B:P1門的細胞表達在CD34/CD45散點圖上，P3門為CD34+CD45dim的細胞，代表前體細胞群； C:P3門的細胞表達在CD19/CD33散點圖上，P4門為CD34+CD19+CD33-的細胞，代表B系前體細胞，P5門為CD34+CD33+CD19-的細胞，代表髓系前體細胞；D:P1門中的細胞表達在CD45/SSC散點圖上，P6門代表淋巴細胞，P7門代表粒細胞； E:淋巴細胞(P6)和髓系前體細胞(P5)的CD45平均熒光強度； F:淋巴細胞(P6)和粒細胞(P7)的側向角峰值

圖2 CD10-FITC/CD45-PC7抗體組合的新參數分析

A:FSC/SSC散點圖上顯示全部有核細胞(P1門)；B:P1門中的細胞表達在CD45/SSC散點圖上，P2門代表淋巴細胞，P3門代表粒細胞；C:P1門的細胞表達在CD10/SSC散點圖上；D:淋巴細胞(P2)和粒細胞(P3)的CD10平均熒光強度

2.2 五參數流式積分系統的建立與驗證在研究組中，改進的流式積分系統新添加了參數五：粒細胞與淋巴細胞CD10平均熒光強度比值，并且重新確立了MDS患者與非MDS患者間各參數的臨界值，定義的各參數標準如下，參數1：全部有核細胞中髓系前體細胞所占百分比≥1.35%；參數2：前體細胞中B系所占百分比≤0.75%；參數3：淋巴細胞與髓系前體細胞CD45平均熒光強度的比值≤1.0或≥7.0；參數4：粒細胞與淋巴細胞側向角峰值的比值≤5.94；參數5：粒細胞與淋巴細胞CD10平均熒光強度比值≤3.15；每個參數符合上述標準計分為1分，否則計分0分。若以≥2分診斷為MDS，研究組內敏感度為85.3%，特異度為87.7%，若以≥3分診斷為MDS，研究組內敏感度下降至50%，但特異度達到96.2%，達到4分均為MDS患者。定義≥2分診斷MDS，積分越高，診斷MDS誤診率越低。

表1 研究組中各參數表達(中位數與范圍)及統計學分析

再次用驗證組驗證上述積分系統的臨床應用價值，31例MDS患者有27例積分達到2分，敏感度為87.1%，149例非MDS患者中僅有16例達到2分，特異度為89.3%，達到4分者均為MDS；其中3例意義未明的血細胞減少患者跟蹤隨訪過程中明確診斷為MDS，均為流式積分3分，提示流式積分對疾病的早期診斷有一定的價值。見表2。

2.3 改進五參數流式積分系統與傳統四參數積分系統的比較分別用兩種積分系統對驗證組中180例患者進行評分，若完全套用傳統Ogata四參數積分法,敏感度為77.4%(24/31)，特異度僅為69.1%(103/149)。采用配對四格表χ2檢驗比較兩種方法診斷效能，差異有統計學意義(χ2=13.581，P<0.001)，改進的五參數流式積分系統對于MDS診斷的敏感度及特異度均較傳統四參數積分系統明顯提高。見表3。

表2 研究組與驗證組中患者的流式積分(n)

表3 兩種積分系統的診斷結果比較(n)

3 討論

到目前為止，骨髓細胞形態學和遺傳學評估仍然是MDS診斷、分類、確定治療方案以及評估預后的基礎[2]，然而染色體異常(包括基因缺失和異位)大約僅在50%的MDS患者中可檢測到，可作為異常克隆造血的依據，細胞形態學在確定MDS診斷上亦有不足，骨髓病態造血并不是MDS的特有標志，很多其他病理條件下也可出現[6]，并且同一標本不同操作者背對背分析可重現性差，骨髓片標本易受操作者制片、染色水平影響，最后，細胞形態學可能因部分患者骨髓細胞過少或骨髓纖維化而難以作出正確判斷。近年來，WHO提倡將流式細胞術免疫分型被作為血液腫瘤診斷、分類、分期和部分疾病監測不可或缺的工具，在MDS診斷上免疫分型可起重要輔助作用[7]。

MDS的克隆轉化主要發生在CD34+造血干細胞水平，以自我更新和分化異常導致細胞形態異常的病態造血為病理特征[8]。MDS患者較正常人前體細胞比例明顯增高，并且向髓系分化為主。MDS原始細胞的其他免疫表型異常亦有報道，包括干細胞和晚期髓系抗原的異常共表達(CD117、CD15等)以及淋系抗原異常表達(CD2、CD5、CD7等)，但是這些流式參數實驗室重現性差，除了淋巴細胞與髓系前體細胞的CD45比值，通過在同一流式通道中兩者細胞之間的調整，在不同操作者之間分析結果差異小[9]。粒細胞側向角減小與骨髓原始細胞成熟障礙以及骨髓發育不良相關，粒細胞與淋巴細胞側向角比值在MDS患者與非MDS患者之間存在差異[10]。

綜上所述，CD34+髓系前體細胞增多，B系前體細胞減少，髓系前體細胞CD45的異常表達，粒細胞側向角峰值和CD10平均熒光強度降低反映了MDS的生物學特征。本研究基于Della Porta et al[11]和Bardet et al[12]整合的Ogata四參數流式積分系統的多中心實驗室研究結果，以及MDS患者粒細胞CD10表達減少特點[13]，在此基礎上新加一參數：粒細胞和淋巴細胞CD10平均熒光強度比值，并且結合各個參數的表達差異，重新設立參考值范圍，改進的五參數流式積分系統在MDS診斷上具有很好的敏感度與特異度，在不同操作者之間可重現性好，且臨床實用性強，易于解讀，所用抗體組合價格不貴，在細胞學和遺傳學無法給出確定診斷時，異常的流式積分有早期診斷價值，協助治療方案的制定。

本實驗可能存在樣本量局限、標本采集不當及實驗結果分析誤差、實驗缺乏國內多中心實驗室結果驗證等問題，需要更多的臨床和實驗室結果驗證。