半滑舌鰨gata5基因的克隆及表達(dá)分析

董忠典，張 寧，崔忠凱，徐文騰，陳松林

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半滑舌鰨基因的克隆及表達(dá)分析

董忠典1,2,3，張 寧1,2,3，崔忠凱2,3，徐文騰2,3，陳松林2,3

（1. 廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088；2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島 266071；3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)國家實(shí)驗(yàn)室 / 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過程功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071）

【】研究半滑舌鰨（）基因（）的序列特征及該基因在半滑舌鰨性腺分化、成熟過程中的表達(dá)模式?！尽客ㄟ^克隆獲得csgata5編碼區(qū)序列，利用熒光定量PCR（RT-qPCR）方法檢測mRNA在不同類型性腺、胚胎和性腺發(fā)育中的表達(dá)模式，借助原位雜交技術(shù)定位mRNA表達(dá)的細(xì)胞類型?！尽靠寺～@得cDNA序列1 777 bp，包含1 167 bp的編碼區(qū)（Coding sequence，CDS），262 bp 的5′UTR 和348 bp的 3′UTR區(qū)，預(yù)測編碼388個(gè)氨基酸殘基（aa），分子質(zhì)量為41.9 ku，等電點(diǎn)為8.90，在C端含有兩個(gè)典型的GATA鋅指結(jié)構(gòu)域；基因組分析顯示位于半滑舌鰨10號(hào)染色體上，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子區(qū)。RT-qPCR分析顯示mRNA在2齡雄魚和偽雄魚精巢中表達(dá)高于卵巢；mRNA主要定位在卵母細(xì)胞、精原細(xì)胞和精子中。胚胎發(fā)育過程中，mRNA表達(dá)在1細(xì)胞期至囊胚期呈下降趨勢(shì)，之后上升，至原腸胚期達(dá)到峰值，隨后降低并維持較低水平至孵化出膜。在精巢發(fā)育過程中，mRNA表達(dá)水平呈升高趨勢(shì)，在1齡達(dá)到檢測的峰值；在卵巢發(fā)育過程中，mRNA表達(dá)趨勢(shì)類似精巢，表達(dá)水平低于同期精巢?！尽繀⑴c半滑舌鰨原腸胚期的組織器官分化，具有促進(jìn)原始生殖細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞分化及雄性生殖細(xì)胞發(fā)育的作用。

半滑舌鰨；；RT-qPCR；原位雜交；性腺分化

半滑舌鰨（）是我國重要海水養(yǎng)殖對(duì)象，其生長具有顯著的性別二態(tài)性，1齡雌魚的體重及生長速度是雄魚的2~4倍[1]。半滑舌鰨性染色體組成類型是ZZ/ZW型，即遺傳雌魚為異型染色體ZW型，遺傳雄魚為同型染色體ZZ型[2]。有些遺傳雌性的半滑舌鰨在人工養(yǎng)殖條件下其性腺會(huì)發(fā)育成精巢，這種魚稱為偽雄魚[3]。研究發(fā)現(xiàn)，偽雄魚可以產(chǎn)生精子繁殖后代，且后代中偽雄魚比例更高，養(yǎng)殖中偽雄魚的存在會(huì)導(dǎo)致養(yǎng)殖群體雄性比例增加，影響產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4]。因此，研究半滑舌鰨的性別決定和分化機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與半滑舌鰨性別決定、分化相關(guān)的基因，培育高雌比例半滑舌鰨品種至關(guān)重要。

通過AFLP、微衛(wèi)星及基因組測序技術(shù)篩選可獲得半滑舌鰨遺傳性別鑒定的分子標(biāo)記[5-7]。Shao等[4]還利用半滑舌鰨的全基因組甲基化測序初步揭示了甲基化與半滑舌鰨性反轉(zhuǎn)的關(guān)系。目前已經(jīng)在半滑舌鰨中鑒定了多個(gè)性別相關(guān)的基因，如、、、、、、等[8-14]。

GATA家族是一類能夠識(shí)別目標(biāo)靶基因啟動(dòng)子區(qū)域GATA基序[T/A(GATA)A/G]，并與之結(jié)合的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在脊椎動(dòng)物的細(xì)胞增殖、生殖細(xì)胞分化和繁殖等生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[15-18]。脊椎動(dòng)物GATA家族主要包含6種GATA基因，可以分為GATA1/2/3亞家族和GATA4/5/6亞家族[19]，其中GATA4/5/6主要表達(dá)于心臟和性腺等內(nèi)胚源組織，對(duì)脊椎動(dòng)物性腺生長和分化起重要作用[20-24]。GATA4能夠通過和剪接因子（splicing factor 1，SF1）的協(xié)同作用激活抗穆勒氏管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）的表達(dá)，引發(fā)繆勒氏管的單向退化從而影響脊椎動(dòng)物性別分化。GATA4和GATA6可以通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞來促進(jìn)精子的成熟[23-30]。GATA5最早被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于非洲爪蟾（）和原雞（）的心臟、腸中，在其他鳥類和兩棲動(dòng)物相同組織中也有表達(dá)，而關(guān)于GATA5在性腺發(fā)育及生殖過程中的研究較少[31-32]。在小鼠（）中，純合GATA5突變體是可育的，但雌性表現(xiàn)出明顯的泌尿生殖系統(tǒng)異常，雄性泌尿生殖系統(tǒng)不受影響[32]。

本研究以半滑舌鰨為研究對(duì)象，利用分子克隆方法獲得編碼序列，熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測了該基因在胚胎和性腺發(fā)育過程中的表達(dá)模式，通過原位雜交技術(shù)明示在精巢和卵巢中的細(xì)胞定位，以期為進(jìn)一步闡明魚類在性腺分化及繁殖過程中的功能提供數(shù)據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所用半滑舌鰨取自山東海陽黃海水產(chǎn)有限公司提供。成魚（2齡）半滑舌鰨雌、雄、偽雄魚各3尾，經(jīng)麻醉劑MS-222麻醉后解剖。取一側(cè)性腺組織于液氮速凍保存用于RNA提取，另一側(cè)性腺組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)4％多聚甲醛PFA固定；分別收集不同發(fā)育時(shí)期的胚胎（1細(xì)胞、32細(xì)胞期、囊胚期、原腸胚期、胚體雛形期、心跳期、晶體期、腦分化期、胚胎扭動(dòng)期、孵化出膜）40~50枚，液氮速凍保存，用于RNA提取。不同生長時(shí)期（52、80、126、150、180、210 d和1 a）性腺取樣如下：解剖后取一側(cè)性腺于液氮中速凍保存，用于RNA提取；另一側(cè)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％的戊二醛固定，用于生理性別鑒定；取部分鰭條于體積分?jǐn)?shù)95%的酒精中保存，用于基因組DNA提取。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

根據(jù)mRNA序列（Genebank: XM_0250 59544）及半滑舌鰨基因組數(shù)據(jù)（GCA_000523025.1）設(shè)計(jì)引物，以（Genebank: XM_008307613.1）作為定量的內(nèi)參基因[14]，引物序列見表1，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

表1 引物及用途

1.3 半滑舌鰨生理及遺傳性別鑒定

半滑舌鰨性腺組織用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2％戊二醛固定12 h后參考Zhang[33]方法進(jìn)行切片制備，觀察生理性別；遺傳性別鑒定參考文獻(xiàn)[7]。

1.4 csgata5克隆及分析

參照Trizol試劑操作說明（Invitrogen，上海）提取各樣本總RNA，經(jīng)電泳和濃度測定后，參照PrimeScriptTMRT regent kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）說明書進(jìn)行cDNA合成。以2齡精巢cDNA為模板，以、為引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系50.0 μL：10× LA Buffer 5.0 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）4.0 μL，上下游引物（10.0 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 3.0 μL，LATaq E 0.5μL，ddH2O 35.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 2 min；變性95 ℃ 30 s，退火 58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃總延伸 10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收純化后鏈接pEASY-T1載體并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌，并將陽性克隆送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果用DNASTAR進(jìn)行結(jié)果比對(duì)拼接，根據(jù)驗(yàn)證后序列設(shè)計(jì)定量、原位雜交引物（表1）用于后續(xù)分析用ChromasPro檢測測序質(zhì)量，用DNASTAR對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接，經(jīng)BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）確定序列準(zhǔn)確后，Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行氨基酸比對(duì)，進(jìn)一步采用鄰位連接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建GATA4/5/6亞家族系統(tǒng)進(jìn)化樹，各節(jié)點(diǎn)置信度采用bootstrap重抽樣1 000次獲得。

1.5 csgata5 mRNA表達(dá)模式分析

通過RT-qPCR方法檢測mRNA在2齡雌、雄、偽雄半滑舌鰨性腺中的表達(dá)模式，以及在胚胎和性腺發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)水平的變化。RT-qPCR反應(yīng)在7500 Fast Real-time PCR儀（Applied Biosystems，美國）上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系如下：7.5 μL 2×SYBR Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)，上、下游引物（10.0 μmol/L）各0.6 μL，0.3 μL ROX Reference Dye II，cDNA 1.5 μL，ddH2O 4.5 μL。RT-qPCR反應(yīng)條件：95℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。以作為內(nèi)參基因?qū)RNA表達(dá)水平進(jìn)行校正，基因相對(duì)表達(dá)水平用2-ΔΔCt計(jì)算，數(shù)據(jù)用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 csgata5 mRNA在性腺中的定位檢測

以&為引物，以精巢cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用和對(duì)純化后PCR產(chǎn)物和pBluescript II SK（+）質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接轉(zhuǎn)化取陽性克隆測序獲得原位雜交重組質(zhì)粒，參照羅氏體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（Roche Diagnostics GmbH，德國）操作說明進(jìn)行地高辛標(biāo)記探針的合成，原位雜交具體步驟參見Dong等[14]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 csgata5序列特征分析

通過克隆測序獲得完整編碼區(qū)（CDS）（1 167 bp）和部分5′UTR（262 bp）、3′UTR（348 bp）區(qū)的cDNA序列共1 777 bp（圖1）；基因組分析表明定位在半滑舌鰨10號(hào)染色體上，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子區(qū)，蛋白編碼起始于第2外顯子，終止于第7外顯子上（圖2）。預(yù)測編碼388個(gè)氨基酸殘基（aa），分子質(zhì)量為41.9 ku，等電點(diǎn)為8.90。在第 190~214 aa 和 245~269 aa 位置分別含有兩個(gè)典型的GATA鋅指結(jié)構(gòu)域（Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys）。

大寫字母表示完整編碼區(qū)CDS，小寫字母表示5′UTR和3′UTR，起始密碼子和終止密碼子用方框標(biāo)注，GATA鋅指結(jié)構(gòu)域用下劃線表示

2.2 GATA家族蛋白序列比對(duì)和進(jìn)化分析

對(duì)半滑舌鰨GATA家族基因結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示GATA1/2/3編碼區(qū)包含5個(gè)外顯子；GATA4/5/6亞家族基因編碼區(qū)包含6個(gè)外顯子（圖2），蛋白序列分析顯示半滑舌鰨GATA家族蛋白的C-端均含有兩個(gè)典型的GATA鋅指結(jié)構(gòu)域（Cys-X2-Cys-X17-Cys-X2-Cys）（圖3）。

圖2 半滑舌鰨GATA家族基因結(jié)構(gòu)示意

方框表示GATA鋅指結(jié)構(gòu)域，箭頭表示保守半胱氨酸位點(diǎn)

在不同物種中，GATA4/5/6亞家族系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（圖4）顯示，GATA4/5/6蛋白分為兩個(gè)分支，GATA6蛋白聚類在一起形成進(jìn)化樹的一個(gè)分支，GATA4和GATA5蛋白聚類在一起作為進(jìn)化樹的另一個(gè)分支。在GATA5蛋白中，半滑舌鰨GATA5蛋白首先和硬骨魚類GATA5蛋白聚類在一起，隨后和爬行類、鳥類、兩棲類及哺乳類的GATA5蛋白聚類在一起。進(jìn)一步對(duì)不同物種及其上下游基因進(jìn)行共線性分析，結(jié)果顯示（圖5），不同物種中與其鄰近的幾個(gè)基因具有保守的共線性關(guān)系。在所比對(duì)物種中下游均為基因，隨后在魚類中依次為、、；在其他脊椎動(dòng)物中則為、、。在上游區(qū)域中基因排列在不同物種中有較大差異：相比于斑馬魚（）、西部錦龜（）、原雞、小鼠、智人（）半滑舌鰨基因和基因之間存在多個(gè)基因的插入。

圖4 GATA4/5/6家族成員系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 gata5與其鄰近基因在半滑舌鰨和其他脊椎動(dòng)物中共線性關(guān)系

2.3 csgata5 mRNA表達(dá)檢測

對(duì)mRNA在2齡半滑舌鰨不同性腺中的表達(dá)進(jìn)行定量檢測，以基因?qū)M(jìn)行校正[14]。結(jié)果顯示mRNA在精巢中表達(dá)水平顯著高于卵巢（＜0.05），在雄性和偽雄魚精巢中表達(dá)水平相近（圖6A）。在胚胎發(fā)育不同階段，mRNA在原腸期表達(dá)最高（圖6B）（＜0.05）；mRNA在受精卵到囊胚期階段表達(dá)水平下降，在原腸胚期表達(dá)突然升高，隨后降低并維持較低水平表達(dá)至孵化出膜，這其中在晶體期mRNA相對(duì)表達(dá)水平相比于其他檢測時(shí)期較高。在精巢發(fā)育過程中，mRNA隨著發(fā)育進(jìn)行表達(dá)水平逐漸升高，在1齡時(shí)期達(dá)到檢測的最高表達(dá)水平（圖6C）（＜0.05），mRNA在相同發(fā)育時(shí)期的卵巢中表達(dá)水平低于卵巢（圖6C），mRNA在52~210 d時(shí)期的卵巢中表達(dá)維持在較低的水平，在1齡卵巢中表達(dá)水平有顯著升高（圖6C）（＜0.05）。

凡有一個(gè)標(biāo)記相同字母即為差異不具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）

2.4 csgata5 mRNA在性腺細(xì)胞的定位

利用合成的RNA探針對(duì)2齡半滑舌鰨雌魚卵巢和雄精巢進(jìn)行原位雜交，結(jié)果如圖7顯示，正義探針在卵巢和精巢中均無雜交信號(hào)（圖7A，C）；反義探針在卵巢的卵母細(xì)胞中有較弱的雜交信號(hào)（圖7 B），在雄魚精巢的精原細(xì)胞和精子中有較強(qiáng)的雜交信號(hào)（圖7 D）。

A：2齡雌魚正義探針雜交結(jié)果；B：2齡雌魚反義探針雜交結(jié)果；C：2齡雄魚正義探針雜交結(jié)果；D：2齡雄魚反義探針雜交結(jié)果；OC：卵母細(xì)胞；SP：精子；SG：精原細(xì)胞；標(biāo)尺：100 μm

3 討論

本研究獲得了完整的編碼區(qū)序列，定位在半滑舌鰨10號(hào)染色體上，包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子區(qū)，蛋白編碼起始于第2外顯子，終止于第7外顯子上。在半滑舌鰨基因組中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)家族成員GATA1/2a/2b/3/4/5/6，都定位在常染色體上。半滑舌鰨GATA1/2/3和GATA4/5/6兩個(gè)亞家族基因編碼區(qū)分別為5個(gè)和6個(gè)外顯子，在半滑舌鰨中含有兩個(gè)成員，即和，這是因?yàn)樵隰~類中發(fā)生了一次復(fù)制[34]。在尼羅羅非魚中同樣鑒定了7個(gè)GATA家族成員，即GATA1/2a/2b/3/4/5/6[35]。GATA4/5/6亞家族系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，GATA成員在物種間的保守性要高于在同一物種內(nèi)GATA家族成員之間的保守性。在進(jìn)化關(guān)系上GATA4/5/6亞家族之間GATA4和GATA5在進(jìn)化關(guān)系上相比于GATA6更接近。

mRNA在2齡半滑舌鰨精巢中的表達(dá)水平顯著高于卵巢，這與半滑舌鰨GATA4/5/6亞家族中和mRNA的表達(dá)模式相似[23-24]，GATA4和GATA6可以通過調(diào)節(jié)支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞來促進(jìn)精子的成熟[23-30, 36-37]，說明GATA5在半滑舌鰨性腺中發(fā)揮了相似的功能。性腺切片原位雜交結(jié)果顯示mRNA主要定在生殖細(xì)胞中。

在脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育過程中，從受精開始到卵裂期很多基因的表達(dá)都受母源效應(yīng)影響[38-39]。本研究中，mRNA主要在半滑舌鰨成熟卵巢的卵母細(xì)胞中表達(dá)，通過母源遺傳給后代，表現(xiàn)為mRNA在卵裂期至囊胚期呈較低表達(dá)水平并持續(xù)下降。在魚類胚胎發(fā)育過程中，原腸胚期主要發(fā)生內(nèi)胚源和中胚源組織器官的分化，而GATA4/5/6亞家族基因主要在內(nèi)胚源和中胚源組織中表達(dá)，故而在該階段mRNA表達(dá)水平顯著升高。

雌性半滑舌鰨在孵化后120 d，卵巢腔形成并開始出現(xiàn)初級(jí)卵母細(xì)胞，200 d左右卵巢腔分化完成，卵巢達(dá)到1期卵巢[40-41]。本研究中，mRNA在52 d至210 d卵巢中維持在較低表達(dá)水平，在1齡時(shí)期表達(dá)水平達(dá)到檢測的峰值，因此，可能不參與半滑舌鰨卵巢的分化，而是在卵母細(xì)胞的成熟中發(fā)揮作用。在雄性半滑舌鰨發(fā)育過程中，孵化后120 d精巢開始出現(xiàn)精小葉，標(biāo)志著精巢開始分化[41]，在150 d精巢內(nèi)形成多個(gè)精小葉，精小葉中含有多個(gè)精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞形成的精小囊，在190 d精巢中出現(xiàn)了初級(jí)精原細(xì)胞、次級(jí)精原細(xì)胞、初期精母細(xì)胞和二期精母細(xì)胞，在225 d有成熟精子發(fā)生[42]。本研究中，mRNA在半滑舌鰨精巢發(fā)育過程中的表達(dá)變化，可能說明該基因在半滑舌鰨原始生殖細(xì)胞向精原細(xì)胞分化以及初級(jí)精母細(xì)胞產(chǎn)生過程中發(fā)揮作用，并且參與了隨后的精子發(fā)生過程，在維持精子成熟中具有重要作用。綜上，具有促進(jìn)原始生殖細(xì)胞向雄性生殖細(xì)胞分化的作用，并維持生殖細(xì)胞的成熟。

[1] CHEN S L, ZHANG G J, SHAO C W, et al. Whole-genome sequence of a flatfish provides insights into ZW sex chromosome evolution and adaptation to a benthic lifestyle[J]. Nature Genetics, 2014, 46(3): 253-260.

[2] ZHUANG Z M, WU D, ZHANG S C, et al. G-banding patterns of the chromosomes of tonguefishGunther, 1873[J]. Journal of Applied Ichthyology, 2010, 22(5): 437-440.

[3] 季相山, 陳松林，馬洪雨, 等. 半滑舌鰨養(yǎng)殖群體中自然性逆轉(zhuǎn)偽雄魚的發(fā)現(xiàn)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2010, 34(2): 322-327.

[4] SHAO C W, LI Q Y, CHEN S L, et al. Epigenetic modification and inheritance in sexual reversal of fish[J]. Genome Research, 2014, 24(4): 604-615.

[5] CHEN S L, LI J, DENG S P, et al. Isolation of female-Specific AFLP markers and molecular identification of genetic sex in half-smooth tongue sole ()[J]. Marine Biotechnology (New York), 2007, 9(2): 273-280.

[6] 劉洋, 陳松林, 高峰濤, 等. 半滑舌鰨性別特異微衛(wèi)星標(biāo)記的SCAR轉(zhuǎn)化及其應(yīng)用[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2014, 22(6): 787-792.

[7] 董忠典, 張寧, 徐文騰, 等. 一種快速鑒定半滑舌鰨遺傳性別的方法[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2016, 24(5): 764-769.

[8] LI H L, XU W T, ZHANG N, et al. Two figla homologues have disparate functions during sex differentiation in half-smooth tongue sole ()[J]. Scientific Reports, 2016, 6(1): 28219.

[9] LI H L, XU WT, ZHU Y, et al. Characterization and expression pattern of r-spondin1 in[J]. Journal of Experimental Zoology Part B Molecular and Developmental Evolution. 2017, 328(8): 772-780.

[10] 鄧思平, 陳松林, 劉本偉, 等. 半滑舌鰨腦芳香化酶基因cDNA克隆及表達(dá)分析[J].動(dòng)物學(xué)研究, 2008, 29(1): 17-24.

[11] DONG X L, CHEN S L, JI X S, et al., Molecular cloning, characterization and expression analysis ofandgenes in half-smooth tongue sole () [J]. Acta Oceanologica Sinica, 2011, 30(1): 68-77.

[12] WANG L N, ZHU Y, XU W T, et al., Molecular characterization ofduring sex development in Chinese tongue sole () [J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2017, 494(3/4): 714-718.

[13] CUI Z, LIU Y, WANG W W, et al, Genome editing revealsas an essential male sex-determining gene in Chinese tongue sole () [J]. Scientific Reports, 2017, 7: 42213.

[14] DONG Z D, ZHANG N, LIU Y, et al. Expression analysis and characterization ofin the Chinese tongue sole () [J]. Gene, 2019, 683: 72-79.

[15] PEVNY L, SIMON M C, ROBERTSON E, et al. Erythroid differentiation in chimaeric mice blocked by a targeted mutation in the gene for transcription factor GATA-1[J]. Nature, 1991, 349(6306): 257-260.

[16] MERIKA M, ORKIN S H. DNA-binding specificity of GATA family transcription factors[J]. Molecular & Cellular Biology, 1993, 13(7): 3999-4010.

[17] KATSUMURA K R, BRESNICK E H. The GATA factor revolution in hematology[J]. Blood, 2017, 129(15): 2092-2102.

[18] LIN H Y, ZENG D, LIANG Y K, et al. GATA3 and TRPS1 are distinct biomarkers and prognostic factors in breast cancer: database mining for GATA family members in malignancies[J]. Oncotarget, 2017, 8(21): 34750-34761.

[19] LOWRY J A, ATCHLEY W R. Molecular evolution of the GATA family of transcription factors: conservation within the DNA-binding domain[J]. Journal of Molecular Evolution, 2000, 50(2): 103-115.

[20] PATIENT R K, MCGHEE J D. The GATA family (vertebrates and invertebrates)[J]. Current Opinion in Genetics & Development, 2002, 12(4): 416-422.

[21] WEN B, YUAN H, LIU X H, et al. GATA5 Sumoylation is indispensable for zebrafish cardiac development[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects, 2017, 1861(7): S0304416517300880.

[22] HEMPEL M, CASAR T T, DIEHL T, et al. Compound heterozygous GATA5 mutations in a girl with hydrops fetalis, congenital heart defects and genital anomalies[J]. Human Genetics, 2017, 136(3): 339-346.

[23] LIU J X，ZHANG W，SUN Y, et al. Molecular characterization and expression profiles of GATA6 in tongue sole () [J]. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 2016, 198: 19-26.

[24] LIU J X，ZHANG W，DU X X, et al. Molecular characterization and functional analysis of the GATA4 in tongue sole()[J]. Comparative Biochemistry & Physiology Part B, 2016, 193(2): 1-8.

[25] BIELINSKA M，SEEHRA A，TOPPARI J, et al. GATA-4 is required for sex steroidogenic cell development in the fetal mouse[J]. Developmental Dynamics, 2010, 236(1): 203-213.

[26] KETOLA I, PENTIK?INEN V, VASKIVUO T, et al. Expression of transcription factor GATA-4 during human testicular development and disease[J]. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism, 2000, 85(10): 3925-3931.

[27] WATANABE K, CLARKE T R，LANE A H, et al. Endogenous expression of Müllerian inhibiting substance in early postnatal rat Sertoli cells requires multiple steroidogenic factor-1 and GATA-4-binding sites[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2000, 97(4): 1624-1629.

[28] ROBERT N M, TREMBLAY J J, VIGER R S. Friend of GATA (FOG)-1 and FOG-2 differentially repress the GATA-dependent activity of multiple gonadal promoters[J]. Endocrinology, 2002, 143(10): 3963-3973.

[29] BOUMA G J，WASHBURN L L，ALBRECHT K H, et al. Correct dosage ofand Gata4 transcription factors is critical for fetal testis development in mice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007, 104(38): 14994-14999.

[30] LI J Z，CHEN W J, WANG D S, et al. GATA4 is involved in the gonadal development and maturation of the teleost fish tilapia,[J]. Journal of Reproduction & Development, 2012, 58(2): 237-242.

[31] WEBER H. SYMES C E, WALMSLEY M E, et al. A role for GATA5 inendoderm specification[J]. Development, 2000, 127(20): 4345-4360.

[32] MOLKENTIN J D, TYMITZ K M，RICHARDSON J A, et al. Abnormalities of the genitourinary tract in female mice lacking GATA5[J]. Mol cell biol, 2000, 20(14): 5256-5260.

[33] ZHANG L Y, LIU W J，SHAO C W, et al. Cloning, expression and methylation analysis of piwil2 in half-smooth tongue sole ()[J]. Marine Genomics, 2014, 18: 45-54.

[34] 葉凱. 尼羅羅非魚GATA因子表達(dá)及其功能的初步研究[D]. 重慶: 西南大學(xué), 2012.

[35] 張未麗, 劉智皓，吳風(fēng)瑞, 等. 轉(zhuǎn)錄因子GATA-2在脊椎動(dòng)物發(fā)育過程中的作用[J]. 四川動(dòng)物, 2009, 28(6): 945-948.

[36] LIU X M, LI Z, WANG B, et al. GATA4 is a transcriptional regulator of R-spondin1 in Japanese flounder () [J]. Gene, 2018, 648: 68-75

[37] LI Z，LIU X, SUN Y, et al. Roles of GATA6 during gonadal development in Japanese flounder: gonadogenesis, regulation of gender-related genes, estrogen formation and gonadal function maintenance[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2017, 18(1): 160.

[38] DE SOUSA P A，CAVENEY A，WESTHUSIN M E, et al. Temporal patterns of embryonic gene expression and their dependence on oogenetic factors[J]. Theriogenology, 1998, 49(1): 115-128.

[39] 馬馨, 張勝, 楊樹寶, 等. 母源效應(yīng)蛋白在基因組印記維持中的作用[J]. 遺傳, 2014, 36(10): 959-964.

[40] 柳學(xué)周, 徐永江, 劉乃真, 等. 半滑舌鰨卵巢發(fā)育的組織學(xué)和形態(tài)數(shù)量特征研究[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2009, 30(6): 25-35.

[41] 劉長琳. 半滑舌鰨麻醉及性腺分化的研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

[42] 吳瑩瑩. 半滑舌鰨精子發(fā)生及其受精過程[D]. 青島: 中國海洋大學(xué), 2008.

Cloning and Expression Analysis ofin Chinese Tongue Sole

DONG Zhong-dian1,2,3, ZHANG Ning1,2,3, CUI Zhong-kai2,3, XU Wen-teng2,3, CHEN Song-lin2,3

（1.,524088,; 2.,,266071,; 3./,266071,）

【】In order to elucidate the gene function ofof Chinese tongue sole（）（）, the sequence characteristics and the expression patterns of this gene in Chinese tongue sole were studied.【】The coding region ofwas obtained by cloning and the expression pattern ofmRNA in embryonic development and gonadal development was detected by real-time PCR（RT-qPCR）.hybridization was used to localize the expression ofmRNA in the gonads.【】ThecDNA sequence is 1 777 bp in length and contains the entire coding region of 1 167 bp, the 262 bp 5′UTR and 348 bp 3′UTR. The location ofis on chromose 10, and it includes seven exons and six introns. The predicted protein ofcontains 388 amino acid residues（aa）, the molecular weight is 41.9 ku, the isoelectric point is 8.90, and it has two typical GATA zinc finger binding domains at the C-terminus. Phylogenetic analysis shows that the same GATA proteins are clustered together, and the clustering pattern is independent of species. The expression levels ofmRNA are higher in the testis of two-years old male and pseudomale than in the ovary of two-years old female and it is mainly localized in the oocytes, spermatogonia and sperm. During embryonic development, the expression levels ofmRNA decrease from the cleavage stage to the blastocyst stage, peak at the gastrula stage, and then decrease and maintain at a lower level until hatching. During the development of testis, the expression levels ofmRNA tend to increase, reaching the peak of detection at the age of one-year old. In the ovary, the expression profile ofmRNA is similar to that of the testis, and the expression level is lower than that of the testis.【】These results show thatmay be involved in the differentiation of organs in the gastrula stage of Chinese tongue sole; it has the effect of promoting the differentiation of primordial germ cells into male germ cells and the development of male germ cells.

;; RT-qPCR;hybridization; gonadal differentiation

S917.4

A

1673-9159（2019）03-0006-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2019.03.002

2019-03-09

黃海水產(chǎn)研究所科研事業(yè)單位基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目（20603022017003）；山東省泰山學(xué)者攀登計(jì)劃項(xiàng)目；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31402293）；廣東海洋大學(xué)博士啟動(dòng)項(xiàng)目

董忠典（1987－），男，博士，講師，研究方向?yàn)樗a(chǎn)生物技術(shù)研究。E-mail：dzhd888@163.com

陳松林（1960－），男，博士，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)生物技術(shù)研究。E-mail：chensl@ysfri.ac.cn

董忠典，張寧，崔忠凱，等. 半滑舌鰨基因的克隆及表達(dá)分析[J]. 廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（3）：6-14.

（責(zé)任編輯：劉朏）