DCLK1敲除對食管鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響

范曉娜 姚健楠 葛 洋 安廣宇 李 鷹*

(1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心，北京 100020; 2.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院腫瘤科，北京 100020 )

食管癌(esophageal cancer，EC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其病死率位居全球消化道腫瘤相關病死率的第6位[1]。根據病理分型，食管癌可以分為食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[2]。在亞洲地區，食管鱗癌為主要的病理類型，約占食管癌診斷的90%以上[3-4]。目前雖然在內窺鏡檢查/手術，化學藥物治療和放射治療中已經取得了顯著的進展，但食管鱗癌的5年存活率仍然很低，僅為15%～25%[5]。因此，尋找食管鱗癌侵襲和轉移的分子標志物，對于食管鱗癌的治療尤為重要。

雙皮質素樣激酶1(doublecortin-like kinase 1，DCLK1)是一種微管相關蛋白激酶，屬于蛋白激酶超家族和雙皮質素家族的成員[6]。目前被認為是結腸癌和胰腺癌中特異性的腫瘤干細胞標志物[7-9]。在許多研究[10-11]中已經報道了DCLK1的高表達，如結腸癌，胰腺癌[12-13]和食管腺癌[14]。近年來，DCLK1作為腫瘤治療的潛在靶點引起了廣泛的關注。靶向DCLK1的小分子激酶抑制劑已被證明可有效對抗體內胃腸腫瘤[15]。重要的是，DCLK1也被證明是某些腫瘤的潛在診斷和預后因素[16-18]。然而，作為一個重要的腫瘤干細胞標志物及潛在的臨床治療靶點，DCLK1在人類食管鱗癌中的潛在作用知之甚少。本研究初步證明了DCLK1在人食管鱗癌中的潛在生物學作用，這可為人類食管鱗癌中分子靶向治療的開發和應用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

RPMI 1640培養基、高糖DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清和嘌呤霉素購自美國Gibco公司；載體lentiCRISPR v2來自于中國醫科學院腫瘤醫院；大腸桿菌感受態細菌stbl3為本實驗室保存；質粒pMD2.G和psPAX2購自美國Addgene公司；BsmBI限制酶購買自New England Biolabs公司；Matrigel膠購自美國BD公司；RNA抽提試劑Trizol和LipofectamineTM3000 試劑盒購自美國Invitrogen公司，、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量 RT-PCR試劑盒購自日本Takara公司，引物合成和測序均由上海生工公司完成；RIPA蛋白裂解液、蛋白抑制劑、PMSF和5×蛋白上樣緩沖液均購自上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜和辣根過氧化物酶化學發光底物購自美國Millipore公司；DCLK1抗體購自美國Abcam公司，其余一抗均購自美國CST公司，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔或抗鼠IgG二抗均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 細胞培養

人食管鱗癌細胞系(Kyse410、Kyse450、Kyse510和Kyse70)和HEK293T細胞均來自中國醫學科學院腫瘤醫院。所有食管鱗癌細胞用含10%(體積分數)胎牛血清和1%(體積分數)青-鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養基培養，HEK293T細胞用含10%(體積分數)胎牛血清和1%(體積分數)青-鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養基培養，于37 ℃ 和5%(體積分數)CO2的培養箱中培養，常規換液傳代。

1.3 構建DCLK1-sgRNA表達載體

特異性靶向DCLK1的sgRNA序列如下：Oligo1：5′-CACCGGAGTAGAGAGCTGACTACCA-3′，Oligo2：5′-AAACTGGTAGTCAGCTCTCTACTCC-3′。使用BsmBI限制酶消化lentiCRISPR v2載體，并與含有雙鏈sgRNA的黏性末端連接。將連接產物轉化stbl3感受態細菌，并在含有氨芐青霉素的平板培養基上篩選，挑取單克隆測序驗證。

1.4 構建穩定敲除DCLK1的食管鱗癌細胞系

使用Lipofectamine 3000將上述構建的DCLK1-sgRNA表達質粒和lentiCRISPR v2空載質粒分別與包裝質粒pMD2.G、psPAX2共轉染到HEK293T細胞中。在轉染后48 h和72 h收取上清液，并用0.45 μm過濾器過濾病毒。用病毒感染食管鱗癌細胞，并用2 μg/mL嘌呤霉素篩選以獲得穩定的細胞系。擴增細胞用于后續實驗。

1.5 總RNA提取和qRT-PCR檢測

Trizol法提取食管鱗癌細胞總RNA，根據PrimeScript反轉錄試劑盒說明書取1 μg RNA反轉錄成cDNA。反轉錄體系為20 μL，反應條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5s，-20 ℃保存。使用GAPDH作為內參進行qRT-PCR，體系為20 μL，反應條件為95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環。實驗重復3次，通過2-ΔΔCT方法計算基因相對表達量。所需引物序列如下：DCLK1-F: 5′-CGGTCCACATGCAATAAAAA-3′，DCLK1-R: 5′-GATATCACCGATGCCATCAAG-3′；GAPDH-F: 5′-AATCCCATCACCATCTTCCA-3′，GAPDH-R: 5′-TGGACTCCACGACGTACTCA-3′。

1.6 蛋白提取和Western blotting法檢測

待細胞生長狀態良好且密度達到80%～90%左右時，棄去原有培養基，用4 ℃預冷磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)緩沖液清洗2次，并吸盡培養瓶中殘留的PBS。吸干后加入新配制的細胞裂解液(1 mL RIPA+10 μL PMSF+10 μL蛋白酶抑制劑)提取細胞總蛋白，并通過BCA法測定總蛋白濃度。取40 μg蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，經半干轉轉至PVDF膜上，5%(質量分數)脫脂奶粉中封閉1 h后，孵育一抗并4 ℃過夜。用TBST洗膜3次，每次5 min，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，最后凝膠成像系統曝光并分析結果。

1.7 劃痕愈合實驗

將DCLK1敲除組(DCLK1-KO)和對照(Control)細胞懸液分別接種在6孔板中。當細胞匯合達到約80%～90%時，使用200 μL移液槍頭垂直底面劃線，PBS洗去劃下細胞，然后將細胞在不含胎牛血清的1640培養基中培養。分別在0、6、24、48 h以4倍放大率拍攝圖像。使用Image J軟件測量相同位置處的劃痕的空白區域。

1.8 Transwell實驗

Matrigel以1∶8稀釋并鋪于Transwell小室底部的上室面，置于37 ℃培養箱2 h，隨后，將不含血清的DCLK1-KO和Control組的細胞懸液分別接種到上室中(105/孔)，將含有10%(體積分數)胎牛血清的細胞培養基加入到每個孔的底部。培養24 h后，取出小室，棄去孔中培養基，甲醇固定20 min，0.1%(質量分數)結晶紫染色20 min，干燥后，于10×放大倍數下各選5個視野計數。

1.9 TCGA食管鱗狀細胞癌數據

通過UCSC癌癥基因組瀏覽器(http://xena.ucsc.edu)下載癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atla，TCGA)數據集中的196名食管癌患者(2017-10-13版)的臨床和基因表達信息。Corrplot函數(R package corrplot)用于證實DCLK1和其他基因的表達水平之間的相關性。

1.10 統計學方法

2 結果

2.1 構建穩定敲除DCLK1的食管鱗癌細胞系

利用qRT-PCR和Western blotting分別檢測4種食管鱗癌細胞系(Kyse450、Kyse70、Kyse410、Kyse510)中DCLK1的基礎表達水平。兩項結果顯示，Kyse450和Kyse70細胞系中DCLK1的mRNA和蛋白水平均高于Kyse510和Kyse410(圖1)。因此，Kyse450和Kyse70兩株細胞用于進行DCLK1敲除實驗的研究。質粒測序結果證實sgRNA成功插入DCLK1-sgRNA表達載體中(圖1C)，可用于后續實驗。Western blotting驗證DCLK1敲除效果，結果顯示，與對照組(Control)相比，Kyse450-KO和Kyse70-KO細胞中DCLK1蛋白明顯減少(圖1D)。

圖1 構建DCLK1敲除的食管鱗癌細胞系Fig.1 Construction of DCLK1 knockout esophageal squamous cell carcinoma (ESCC) cell lines

A: DCLK1 mRNA expression in four ESCC cell lines (Kyse410， Kyse450， Kyse510， Kyse70);B: DCLK1 protein expression in four ESCC cell lines;C: Sequencing results of DCLK1-sgRNA expression vector;D: Western blotting analysis ofDCLK1 knockout effect in Kyse450 and Kyse70 cells.***P<0.001.DCLK1：doublecortin-like kinase 1；DCLK1-KO:DCLK1 knockout.

2.2 劃痕實驗檢測DCLK1敲除對食管鱗癌細胞遷移能力的影響

在Kyse450細胞中，DCLK1-KO組細胞在6、24 h和48 h的劃痕愈合速率分別為15.20%、38.30%和54.60%，對照組的愈合率為46.60%、77.70%和100.00%。Kyse70細胞的DCLK1-KO組在6 h，24 h和48 h的劃痕愈合速率分別為2.90%、5.50%和9.30%，相應的對照組愈合率為10.50%、17.00%和28.60%。兩種細胞的統計學分析顯示，與對照組相比，DCLK1-KO組細胞劃痕愈合率均明顯降低(t=22.742，P<0.01;t=22.901，P<0.01;t=30.267，P<0.01)(t=14.113，P<0.01;t=14.880，P<0.01;t=21.875，P<0.01)(圖2)。

2.3 Transwell實驗檢測DCLK1敲除對食管鱗癌細胞遷移、侵襲能力的影響

在無Matrigel膠的小室中，Kyse450和Kyse70細胞的DCLK1-KO組穿出的細胞數分別為180.00±16.97和205.50±10.61，均明顯少于相應的對照組穿出細胞數515.50±27.58和437.50±17.68，DCLK1敲除可顯著抑制食管鱗癌細胞的遷移能力(t=14.653，P<0.01;t=15.915，P<0.01)(圖3A)，這與劃痕實驗結果一致。侵襲實驗結果顯示，Kyse450和Kyse70細胞的DCLK1-KO組細胞侵襲數分別為158.50±12.02和121.00±12.73，顯著低于相應的對照組細胞侵襲數345.00±15.56和416.00±9.89，差異有統計學意義(t=13.416，P<0.01;t=25.873，P<0.01)(圖3B)。

圖2 DCLK1敲除對食管鱗癌細胞遷移能力的影響Fig.2 Effect of DCLK1 knockout on migration ability of esophageal squamous carcinoma (ESCC) cells

圖3 DCLK1敲除對食管鱗癌細胞遷移和侵襲能力的影響Fig.3 Effect of DCLK1 knockout on migration and invasion ability of esophageal squamous carcinoma (ESCC) cells

A: effect ofDCLK1 knockout on migration ability of esophageal squamous carcinoma cells；B: effect ofDCLK1 knockout on invasion ability of esophageal squamous carcinoma cells.**P<0.01.DCLK1：doublecortin-like kinase 1；DCLK1-KO：DCLK1 knockout.

2.4 Western blotting法檢測DCLK1敲除對食管鱗癌細胞EMT的影響

兩種食管鱗癌細胞的DCLK1敲除均顯著上調了上皮指標E-cadherin蛋白的表達(t=6.559，P<0.05;t=4.860，P<0.05)，而降低了間質指標如ZEB1、Snail和Slug的表達水平(t=9.204，P<0.05;t=23.781，P<0.01;t=13.892，P<0.01)，另外在Kyse450細胞中Vimentin蛋白降低(t=7.938，P<0.05)(圖4)。

2.5 TCGA數據庫分析食管鱗癌患者中DCLK1與EMT相關轉錄因子的相關性

進一步分析了TCGA數據庫并檢查了食管鱗癌患者中DCLK1表達與EMT相關轉錄因子之間的相關性，DCLK1表達與間質標志物ZEB1、ZEB2、Vimentin、FN1、CDH2、Snail、Slug和Twist1和Twist2呈正相關(紅色)，但與CDH1、CLDN4、CLDN7、MUC1和TJP3等上皮標志物呈負相關(圖5)。

圖4 DCLK1敲除對食管鱗癌細胞上皮-間質轉化的影響Fig.4 Effect of DCLK1 knockout on epithelial-mesenchymal transition of esophageal squamous carcinoma cells

圖5 DCLK1與上皮-間質轉化相關轉錄因子的數據庫分析Fig.5 Relationship between DCLK1 and epithelial-mesenchymal transition associated transcription factors

Red: positive correlation;Green: negative correlation；DCLK1：doublecortin-like kinase 1.

3 討論

在我國，食管鱗癌占比高達97%以上[4]。作為一種我國的高發腫瘤，食管鱗癌發生、發展機制的研究具有很大的臨床價值。近年來，靶向治療以其對癌細胞的特異性在腫瘤治療中的地位變得越來越重要。腫瘤干細胞標志物DCLK1已被證實在多種腫瘤中表達上調，并且直接參與腫瘤的轉移調控。本研究初步探索了DCLK1對食管鱗癌細胞生物學行為的影響，通過CRISPR/Cas9基因編輯技術靶向敲除DCLK1后，觀察到食管鱗癌細胞的遷移和侵襲能力明顯降低，提示DCLK1可能是參與食管鱗癌細胞侵襲轉移的一個重要因子。

Chandrakesan等[19]的研究顯示，敲減DCLK1可減少結腸息肉、腺瘤和腺癌的數量和體積，提示DCLK1與結腸癌發生、發展密切相關。此外，大量的研究[12-13]表明，敲除DCLK1不僅能夠抑制體外和體內細胞的生長，而且顯著抑制胰腺癌細胞和腎癌細胞[20]的遷移和侵襲。這些結果證明了DCLK1在多種腫瘤的轉移過程中發揮重要作用。研究[18]顯示，上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在促進食管鱗癌的侵襲和轉移中起重要作用。因此，筆者推測DCLK1可能通過調節EMT進程影響食管鱗狀細胞癌的侵襲和轉移。之后，對EMT相關轉錄因子的蛋白質印跡分析驗證了這一假設，本研究結果顯示隨著DCLK1的敲除，間質標志物如Vimentin、ZEB1、Slug和Snail的表達減少，而上皮標志物E-cadherin的表達增加。此外，TCGA數據庫分析結果顯示，DCLK1表達與間質標志物ZEB1、ZEB2、Vimentin、FN1、CDH2、Snail、Slug和Twist1和Twist2呈正相關，但與CDH1、CLDN4、CLDN7、MUC1和TJP3等上皮標志物呈負相關，這與本研究結果一致。這些發現表明DCLK1可通過誘導EMT促進食管鱗癌腫瘤發生。

CRISPR/Cas9系統是一項新興的基因編輯技術，以其簡單、高效和多功能性在體外和體內都獲得了廣泛的認可，并成功應用于編輯人類基因組[21-22]。本實驗基于CRISPR/Cas9基因編輯技術獲得了穩定敲除DCLK1的食管鱗癌細胞系，為進一步探索DCLK1在食管鱗癌進展中分子機制提供了堅實的基礎。

盡管目前對DCLK1的研究逐步深入，但本研究結果初步證明了DCLK1在食管鱗癌中的生物學作用，這是第一次證明DCLK1可能作為食管鱗癌中EMT信號傳導的調節因子，為臨床食管鱗癌治療提供了一個新的思路。另外，仍需進一步深入探討DCLK1影響EMT進程的分子機制。