模擬正畸靜壓力刺激牙周膜干細胞增殖的TGFβ/STAT信號通路探討

劉 黎，趙新華，秦志勇

隨著人們生活水平的提高和對生活品質的重視，牙齒正畸在臨床上得到越來越廣泛的應用[1-2]。牙齒正畸是通過牙齒在機械力的作用下使之沿牙槽骨移動達到牙周組織的適應性改建的目的[3]。牙周膜干細胞是牙周組織再生的關鍵細胞，具有廣泛增殖和分化成基質細胞的潛能[4]。細胞凋亡是細胞的自主過程，但是目前尚未見到關于牙齒正畸過程中對牙周膜干細胞影響的報道[5]。TGFβ/STAT信號通路參與了細胞內的多種生理及病理過程，且與牙周疾病的發病和治療密切相關[6]。本研究旨在分析模擬正畸靜壓力刺激牙周膜干細胞增殖的TGFβ/STAT信號通路參與機制，為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞及試劑 牙周膜干細胞采用全牙消化法原代培養(材料來自我院頜面外科正畸拔除的前磨牙)，經低密度接種法篩選培養至第4代并經成骨誘導和成脂誘導后檢測相關蛋白確認后作為研究材料(培養條件37 ℃、5%二氧化碳)。細胞總蛋白提取試劑盒購自碧云天公司；α-MEM培養液購自Gibco公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；PPARγ及lpl第一抗體購自R&D公司；ALP及sp7第一抗體購自美國Abcam公司；二抗及顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Bax及Bcl2一抗購自Santa Cruz公司；酶標儀購自累杜公司；超凈工作臺購自賽默飛世爾公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；二氧化碳細胞培養箱購自賽默飛世爾公司；高速冷凍離心機購自Eppendorf公司；垂直電泳儀及轉膜儀購自伯樂公司。

1.2 分組及處理方法 成骨誘導和成脂誘導后確認的牙周膜干細胞培養至狀態良好后進行處理：加壓至100 kPa分別處理1、6、12 h，檢測細胞的增殖及相關蛋白的表達情況。注意確認加壓過程中加壓艙的密閉性和恒定性。將同類型牙周膜干細胞置于相同的加壓艙內但不進行加壓作為對照組。

1.3 Western blotting法 將加壓處理組和對照組細胞提取總蛋白并定量后，以相同量總蛋白進行SDS-PAGE垂直電泳。電泳結束后進行半干法轉膜(30 min，330 mA)。轉膜后將硝酸纖維素膜進行BSA的封閉。然后將封閉后的纖維素膜與待檢測分子的一抗(1∶200)進行孵育90 min，沖洗3次后將沖洗后的纖維素膜與二抗(1∶600)進行雜交90 min。PBS沖洗后進行顯色，拍照。

2 結 果

2.1 多向分化能力鑒定牙周膜干細胞 牙周膜干細胞經成脂誘導后PPARγ蛋白和lpl蛋白的表達水平明顯升高(P<0.05，表1)，牙周膜干細胞經成骨誘導后ALP蛋白和sp7蛋白的表達也明顯升高(P<0.05，圖1)。

圖1 多向分化能力鑒定牙周膜干細胞

2.2 加壓處理對牙周膜干細胞細胞增殖影響 與對照組相比，牙周膜干細胞經加壓處理1 h和6 h后增殖被顯著抑制(P<0.05)，且Bax的表達明顯升高(P<0.05)而Bcl2的表達明顯降低(P<0.05)，而處理12 h細胞的增殖情況及上述蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05，圖2、3，表2)。

圖2 加壓處理對牙周膜干細胞細胞增殖影響

圖3 加壓處理對牙周膜干細胞細胞凋亡蛋白表達的影響

1.對照組處理1 h；2.加壓處理1 h；3.對照組處理6 h；4.加壓處理6 h；5.對照組處理12 h；6.加壓處理12 h

2.3 加壓處理對牙周膜干細胞TGFβ及STAT蛋白表達的影響 與對照組相比，牙周膜干細胞經加壓處理1h和6h后TGFβ及STAT2的表達明顯升高(P<0.05)，而處理12 h的細胞增殖情況及上述蛋白表達無統計學差異(P>0.05，圖4，表3)。

組別對照組加壓處理組tPBcl2/β-actin 處理1 h0.40±0.050.33±0.052.645<0.05 處理6 h0.41±0.070.29±0.053.358<0.05 處理12 h0.40±0.040.39±0.070.425>0.05Bax/β-actin 處理1 h0.26±0.040.34±0.052.584<0.05 處理6 h0.27±0.060.42±0.083.154<0.05 處理12 h0.26±0.050.27±0.040.542>0.05

圖4 加壓處理對牙周膜干細胞細胞TGFβ及STAT蛋白表達的影響

1.對照組處理1 h；2.加壓處理1 h；3.對照組處理6 h；4.加壓處理6 h；5.對照組處理12 h；6.加壓處理12 h

組別對照組加壓處理組tPTGFβ/β-actin 處理1 h0.30±0.050.34±0.062.365<0.05 處理6 h0.31±0.080.39±0.072.854<0.05 處理12 h0.30±0.060.30±0.080.441>0.05STAT2/β-actin 處理1 h0.28±0.080.32±0.063.147<0.05 處理6 h0.28±0.070.43±0.082.548<0.05 處理12 h0.28±0.050.29±0.070.228>0.05

3 討 論

以往的研究也證實正畸過程涉及多種信號轉導通路的參與，其中集中在MAPK信號通路，Wnt/β-catenin信號通路，PI3K/AKt/m TOR信號通路，BMP-2信號通路，Caspase-3介導的凋亡通路較多[7]。在分析玻璃離子水門汀對青少年正畸后局部組織炎性反應、細胞凋亡及膠原代謝影響的研究中也發現玻璃離子水門汀用于青少年正畸能夠較牙釉質黏合劑更為有效地抑制炎性反應、細胞凋亡，并改善膠原代謝[8]。在分析增齡性因素對正畸牙齒移動過程中牙周組織細胞凋亡時也證實細胞凋亡可能參與了正畸牙齒移動，但是增齡性因素使得成年組牙周組織細胞凋亡增加，進而影響各類細胞比例,改變牙周組織改建的速度和效果，使得牙齒移動速度減慢[9]。本研究也發現加壓處理1 h和6 h后細胞Bax明顯增強而Bcl2水平明顯減弱，表明模擬正畸靜壓力刺激可明顯抑制體外培養的牙周膜干細胞的增殖過程。

TGFβ/STAT信號通路相關蛋白可能參與了牙齒的正畸過程。在分析骨膜蛋白在正畸牙周膜改建中的表達及調控機制時發現TGFβ-B1-PN-FAK可能通過激活下游的Akt磷酸化信號通路,對正畸力牙周膜改建中進行調控[10]。在分析正畸驅動的骨皮質切開術對巨噬細胞的作用及機制進行研究時也證實正畸驅動的骨皮質切開術通過活化并促進巨噬細胞的分型進而影響牙槽骨密度并促進牙齒的移動，其中NF-κB及JAKSTAT信號通路的激活可能發揮重要作用[11]。以往的研究也發現正畸力作用下大鼠前扣帶皮質層中STAT1表達水平一過性降低,p-STAT1表達水平一過性升高，推測正畸疼痛的產生可能與前扣帶皮質層STAT1活化為p-STAT1有關[12]，且25 g/cm2靜壓力作用下HGFs中的TGF-β1的表達有關[13]。在分析信號轉導和轉錄活化因子3在正畸力介導的骨改建中的表達時也發現正畸力可增強牙槽骨改建，張力區STAT3的表達改變可能與正畸牙移動的骨改建相關[14]。但上述研究均未對牙周膜干細胞的凋亡情況及相關分子機制進行研究。本研究發現加壓處理1h和6h后細胞Bax明顯增強而Bcl2水平明顯減弱，TGFβ/STAT信號通路蛋白TGFβ及STAT2表達明顯增強，而處理12時干細胞的上述蛋白表達無明顯差異，表明模擬正畸靜壓力刺激可明顯抑制體外培養的牙周膜干細胞的增殖過程，其可能與TGFβ/STAT信號通路異常有關。

因此，模擬正畸靜壓力刺激可明顯抑制體外培養的牙周膜干細胞的增殖過程，其可能與TGFβ/STAT信號通路異常有關。