胞外組蛋白與急性器官損傷的關系

王宏鑫，王 萌，張煜偉，李光宗 綜述 王力軍 審校

組蛋白是真核生物染色體的基本結構蛋白。細胞內組蛋白由五種蛋白構成：H2A、H2B、H3、H4以八聚體的形式，組成核小體的核心結構；H1位于核小體以外，穩定染色質三級結構。H1、H2A和H2B富含賴氨酸，而H3和H4主要由精氨酸組成。作為核小體骨架，胞內組蛋白具有維持染色體穩定、參與DNA的轉錄、復制及修復等功能[1]。若胞內組蛋白易位至細胞外，即為細胞外組蛋白(extracellular histone, EH)。EH通過影響TLR2/TLR4/TLR9信號通路、增加細胞膜通透性介導炎性反應、激活血小板及中性粒細胞等，對腦、心臟、肺臟、肝臟、腎臟和胰腺等造成損傷，甚至發生多器官衰竭[2]。筆者就EH對器官損傷及其發病機制做一綜述。

1 EH的來源及影響

EH多來源于細胞凋亡或壞死時染色質發生降解，以游離組蛋白、DNA結合組蛋白(核小體)及中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps, NETs)形式釋放到胞外[3]。游離型即刻致死性明顯高于結合型。肽基精氨酸脫亞氨酶4(peptidylated arginine deaminase,PAD4)促進組蛋白中精氨酸瓜氨酸化，誘發DNA解螺旋，導致細胞死亡[4]。少量組蛋白可迅速被單核巨噬細胞清除。患者感染膿毒癥等疾病時，細胞死亡釋放的組蛋白超過機體清除能力，EH水平升高。

固有免疫細胞死亡時釋放包含組蛋白的NETs，此過程稱為NETosis。NETs兼具保護和損傷機體的作用。機體感染時中性粒細胞釋放的顆粒蛋白和染色質形成保護網，過濾并殺死致病菌[4]。NETosis亦可導致血小板聚集、血栓形成、自身免疫和細胞毒性[5]。NET誘導的血管內凝血取決于H4、血小板和無機多磷酸鹽之間的相互作用[5，6]。目前尚不清楚NETosis的始動機制[7]。但更多證據表明TLR2/TLR4和補體在啟動固有免疫細胞死亡中可能發揮重要作用[8，9]。

2 EH介導炎性反應的機制

2.1 通過TLR信號通路 缺血、創傷等觸發內皮細胞死亡，胞內物質(如組蛋白等)釋放到細胞外。這些物質結合、激活特異Toll樣受體(toll like receptors, TLRs)，提高NF-κB介導的促炎因子轉錄。缺氧性線粒體功能障礙后活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，上調TLRs。活化TLR(尤其是TLR2和TLR4)通過MyD88-依賴途徑促進IL-6和TNF-α等促炎因子釋放。此外，TLR還介導損傷相關分子信號傳遞。TLR2和TLR4基因敲出小鼠模型可免于致死劑量組蛋白的危害，提示EH可能通過TLR2和TLR4發揮作用[10，11]。

在肝缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, I/R)模型中，EH介導TLR9活化，誘導IL-6和TNF-α等促炎因子釋放[12，13]。在無菌性炎性反應中，TLR9的活化可能有助于NLRP3炎性小體的聚集。在枯否細胞中，激活的組蛋白-TLR9介導線粒體ROS生成及活化NLRP3炎性小體。TLR9和NLRP3基因敲除后可完全阻斷以上過程[14]。EH激活TLR9的原因可能是結合組蛋白DNA發揮DNA-TLR9-依賴的損傷相關分子的作用，同時增強DNA-TLR9信號傳導[13]。

2.2 增加胞膜通透性 EH對上皮和內皮組織可直接產生細胞毒性作用。注射高劑量EH后，細胞活性顯著降低。Pereira等[15]首先論述陽離子組蛋白和陰離子磷脂之間的離子鍵合。EH與磷脂-磷酸二酯鍵結合后，改變膜通透性，促進鈣離子內流，導致細胞功能降低[16]。C-反應蛋白通過競爭結合磷脂位點，阻斷EH與其結合，使其不能進入胞內，發揮抑制鈣內流及保護細胞免受EH毒性的作用[17]。

此外，EH可活化血小板。血小板活化后釋放Poly P，進而激活FⅫ和補體，促進凝血和組織損傷、水腫和炎性反應。激活的血小板和中性粒細胞，促進NETosis，提高EH水平。此過程相互促進，形成惡性循環，最終導致多器官損傷[2]。

3 EH與急性器官損傷的關系

3.1 腦 腦血管病是全球發病率和病死率最高的疾病之一。栓塞致腦灌注急劇減少及不可逆性炎性神經損傷。低氧灌注刺激胞內核小體釋放到循環系統。與對照組相比，暴露于缺氧環境的小鼠核小體水平升高3倍，而缺血性卒中模型顯示核小體水平升高達7倍[18]。EH在I/R模型中的負性作用可能是對內皮細胞及血腦屏障造成直接毒性作用、提高其通透性及白細胞遷移和免疫刺激[18]。另外，EH激活血小板，再灌注期時可進一步增加缺血風險[19]。

阿爾茨海默病和帕金森等神經炎性疾病患者EH水平升高[20]。EH損傷膠質細胞，影響其功能。免疫源性的小膠質細胞在此病理過程中發揮重要作用。實驗表明H1(而非核心組蛋白)通過促進小膠質細胞存活，具有劑量依賴的神經毒性[21]。此外，H1通過激活星型膠質細胞，提高其反應性，發揮神經免疫調節功能。

3.2 心臟 心肌損傷與I/R后氧輸送減少、胞內免疫源性物質(如組蛋白)釋放有關。反復缺血常導致發生不可逆性心肌損傷，出現心力衰竭。心肌梗死早期即發現組蛋白積聚于心肌細胞內，心肌損傷程度與組蛋白水平相關[22]。NETs釋放的核小體也參與心臟局部缺血后的炎性信號傳導。缺乏PAD4酶的小鼠心肌梗死后血核小體水平較低。能夠水解NETs的脫氧核糖核酸酶1(deoxyribonuclease1, DNase1)顯著改善心室重塑，提高局部心肌細胞存活率，改善心肌功能并減少中性粒細胞浸潤。可能是因DNase1分解組蛋白，預防進一步的心臟毒性。但EH仍可隨血流傳播，損傷其他器官[23]。此外，EH尚可通過補體系統誘導膿毒癥心肌損傷[23]。

3.3 肺臟 輸血、創傷或缺血引起的急性肺損傷，常影響肺泡及內皮細胞功能，導致氣體交換不足、蛋白滲出增加、細胞死亡、炎性反應甚至呼吸衰竭。輸血后可出現顯著的NETs介導的炎性反應[24]。NETs可加重肺水腫，提高血管內皮通透性[23]。目前尚不明確組蛋白、DNA及顆粒蛋白在NETs內，抑或組成復合物介導肺的炎性反應或細胞死亡。Caudrillier等[24]發現，注射EH后小鼠肺泡細胞活性明顯下降，預孵育抗組蛋白(H1-DNA、H2A、H2B和H4)抗體顯著降低NETs介導的細胞毒性。進一步研究顯示H1和H4(非H3)誘導肺細胞死亡，抗H4抗體顯著降低促炎信號傳導及急性肺損傷嚴重程度，而抗H3抗體無此作用[8]。

免疫組化顯示組蛋白與磷脂上的磷酸二酯鍵相互作用(類似于DNA-組蛋白結合位點)，積聚在內皮細胞膜周圍，導致膜通透性增加，鈣離子內流和細胞死亡[25]。提示游離組蛋白具有非特異性、不依賴于TLR的細胞毒性作用。此外，陰離子聚糖及聚唾液酸通過結合EH，發揮保護作用[23]。

3.4 肝臟 無菌性肝炎時EH激活枯否細胞的TLRs，啟動細胞因子風暴[11]。刀豆素和對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷模型中，EH水平升高，抗組蛋白治療及敲除TLR2/TLR4則具保護作用[10]。EH通過TLR4/TLR9刺激中性粒細胞形成NETs。NETs刺激免疫源性枯否細胞釋放促炎因子。與急性肺損傷不同，H3與肝損傷程度具有顯著的相關性，抗H3抗體可減輕肝損傷嚴重程度，同時降低死亡風險和血清TNF-α和IL-6水平。NETs也介導肝細胞毒性[26]。NETosis抑制劑、PAD4抑制劑和DNase1均可降低EH介導的NETs和肝損傷標志物水平。

3.5 腎臟 急性缺血性腎損傷臨床常見，發病率和病死率高。急性腎缺血時，組蛋白通過壞死的腎小管上皮細胞釋放到細胞外。EH依劑量依賴性的方式，對腎內皮細胞和腎小管上皮細胞產生毒性。表現為白細胞黏附、血管通透性增加和腎動脈內跨內皮遷移。使用抗H4抗體中和組蛋白活性后，細胞因子及趨化因子表達降低[27]。TLR2/TLR4可能通過MyD88-NFκB及MAPK途徑，介導并激活促炎反應；MyD88和TLR雙敲除的動物，促炎反應降低[28]。

3.6 胰腺 EH水平與胰腺腺泡壞死數量和嚴重程度緊密相關。胰腺灌注降低后即出現胰腺損傷，表現為胰酶升高和組織炎性反應。在膽囊結石和膽囊收縮素誘導的壞死性胰腺炎中，EH水平明顯升高，而單純水腫和炎性反應不會導致EH升高。此外，高遷移率族組蛋白-1(high mobility group box protein-1，HMGB-1)能夠保護細胞免受氧化應激和DNA斷裂，EH通過促進固有免疫細胞分泌HMGB-1，導致胞內HMGB-1水平降低，從而加劇胰腺腺泡細胞DNA損傷[1]。胰腺炎時EH水平升高能與HMGB-1缺乏有關[29]。抗H3抗體可能有助于胰腺炎的治療[29]。

總之，EH通過TLR信號通路、增加胞膜通透性 等機制，導致機體腦、心臟、肺臟、肝臟、腎臟、胰腺等重要器官損傷。EH水平可反映急性器官損傷的嚴重程度，器官損傷糾正后后，其水平隨之下降。此外，EH也是治療靶點之一[30-33]。切斷組蛋白從胞內向胞外易位、中和循環中組蛋白、使用EH抗體及阻斷組蛋白信號轉導等措施，可能是將來治療的新方向。