人型結核分枝桿菌H37Ra在構建實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠模型中的應用

井 峰，陳 兵

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種T細胞依賴、B細胞介導的自身免疫性疾病，其主要發病機制為突觸后膜乙酰膽堿受體(acetylcholine receptor，AChR)破壞，導致神經肌肉接頭傳遞障礙，進而引起骨骼肌無力。實驗性自身免疫性重癥肌無力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)動物模型因發病機制、臨床表現、電生理特點、免疫學特點等方面與人類MG相似，已成為研究MG重要的工具，被廣泛地用于MG發病機制的研究及治療方案的探索。構建EAMG動物模型有多種方法，近年來國內多項實驗均使用大鼠源性AChR蛋白α亞單位97-116肽段(R97-116)為免疫原接種大鼠而建立EAMG動物模型進行研究[1, 2]。按照現有實驗方案，使用R97-116為免疫原造模時需使用結核菌H37Ra作為耗材。H37Ra是人型結核分枝桿菌的減毒株，其具有H37Rv毒株的免疫原性，但無致病性[3]。H37Ra在我國尚無試劑公司進行規模化生產，國外雖有商品化制劑，但由于試劑管控原因，難以從正規途徑獲得。是否可以在缺少H37Ra的情況下仍能以R97-116為免疫原成功建立EAMG模型尚未可知，查閱文獻目前無相關研究報道。在本研究中，我們將以R97-116為免疫原接種Lewis大鼠，探討H37Ra在該方案中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物使用雌性近交系SPF級Lewis大鼠，6～8周齡，平均體重(157.62±6.43)g，采購于北京維通利華有限公司。實驗動物共30只，分為實驗組、對照組、空白對照組，每組10只。3組動物在完全相同的條件下飼養于我院實驗動物中心。R97-116肽段序列為D GD F A I V K F T K V L L D Y T G H I，分子量為2252.57，產品純度>95%，委托金斯瑞生物技術公司合成。完全弗氏佐劑(complete Freund’s Adjuvant, CFA)和不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s Adjuvant, IFA)均購于sigma公司。PBS緩沖液，購于北京中衫金橋生物技術有限公司。結核菌H37RA干粉購于BD(Difico)公司。大鼠AChR-Ab ELISA檢測試劑盒，購于北京瀚科恒譽生物科技有限公司。

1.2 方法 本實驗參照Baggi等[4]的造模方法進行操作。將R97-116溶于PBS溶液中，配制濃度為1 mg/ml。首次接種時，R97-116溶液、CFA、PBS按照1∶1.5∶1.5進行配比，充分震蕩混勻制成乳劑。使用微量注射器在大鼠足墊、背部、腹部多點進行皮下注射，每只大鼠注射混合乳劑共200 μl。實驗組所用乳劑每200 μl中加入H37RA干粉1 mg，對照組不添加H37Ra，空白對照組在皮下注射等量生理鹽水。首次接種后的30、45、60 d進行強化接種。強化接種試劑按以下方案配比：R97-116、IFA、PBS比例1∶1.5∶1.5，混合震蕩為乳劑。使用微量注射器在大鼠足墊、背部、腹部多點進行皮下注射，每只大鼠注射混合乳劑200 μl。實驗組所用乳劑每200 μl中加入H37RA干粉1 mg，對照組不添加H37Ra，空白對照組在相同時間于皮下注射等量生理鹽水。

1.3 臨床評估及抗體檢測 實驗動物每周稱重1次。對大鼠進行分級前先使大鼠反復抓握籠頂30 s，以模擬疲勞試驗的效果。動物模型臨床癥狀評估采用Lennon等[5]制定的大鼠EAMG動物模型臨床分級標準：0級，未出現無力癥狀；1級，活動輕度減少、撕咬無力、抓握力或叫聲減弱且易疲勞，尤其在重復抓握活動后更明顯；2級，無力癥狀明顯，在抓握前就出現震顫、低頭、隆背、抓握力弱；3級，在抓握前即有嚴重的肌無力表現，無力抓握，處于瀕死狀態；4級，死亡。癥狀居中者評分分別為 0.5、1.5、2.5、3.5。麻醉大鼠后于尾靜脈取血，離心后取血清，使用ELISA法對所取血清的抗體進行檢測。

2 結 果

實驗前5周各組大鼠均未出現明顯肌無力癥狀，Lennon分級均為0。第6周后實驗組大鼠出現明顯肌無力表現，部分死亡；對照組僅有2只出現輕微癥狀，其余正常。空白對照組大鼠無異常表現。至結束時，實驗組Lennon分級：4級3只，3～3.5級2只，2～2.5級2只，1～1.5級2只，0級1只。對照組1級2只，其余8只均0級。空白對照組均0級。實驗組中Lennon分級為1～3.5級的6只大鼠AChR抗體檢測均為陽性，0級的大鼠可疑陽性。對照組中Lennon分級為1級的2只大鼠中1只抗體可疑陽性，另1只陰性，Lennon分級為0級的8只大鼠抗體為陰性其余8只大鼠均為陰性。空白對照組抗體檢測均為陰性。實驗結束時，實驗組大鼠接種處皮膚出現脫毛、潰爛、結痂，足墊腫脹明顯并伴有炎性滲出物，提示局部炎性反應(圖1A、B)，大鼠活動明顯減少，撕咬、鳴叫力弱，靜止狀態下呈隆背姿態(圖1C、D)，可發現明顯震顫，以上癥狀在持續抓握籠頂或活動后更為明顯，肌無力癥狀明顯，同時體重降低。對照組大鼠僅在局部接種處出現炎性反應，未觀察到明顯肌無力癥狀，僅2只大鼠出現輕微無力癥狀。空白對照組未發現異常變化。實驗結束時，實驗組大鼠體重[(190.21±8.35)g]，較對照組[(243. 22±7.98)g]和空白對照組[(251.22±5.81)g]低，差異均有統計學意義(P<0.05)；對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義(表1)。

圖1 實驗組大鼠接種處及活動狀態

A、B.實驗組大鼠足墊、皮膚接種處出現腫脹、潰爛等局部炎性反應；C.正常大鼠靜止狀態下的姿態；D.實驗組大鼠活動減少，靜止狀態下低頭、隆背

時間實驗組對照組空白對照組0周156.13±3.24158.33±2.55157.61±4.422周169.77±4.12168.65±3.03169.97±3.244周181.37±3.22184.52±6.41186.71±5.126周199.45±6.41①210.35±7.85216.33±5.328周197.64±8.41①232.51±8.41238.32±4.2410周190.21±8.35①243.22±7.98251.22±5.81

注：與對照組、空白對照組比較，①P<0.05

3 討 論

據文獻[6]記載，首只EAMG動物模型是Patrick在1973年使用從電鰻中提純AChR蛋白接種免疫家兔構建而成。此后的研究發現大鼠、小鼠、豚鼠、猴均可用于EAMG模型的建立，其中又以大鼠最為常用。EAMG建模方案包括主動和被動免疫，主動免疫建模的過程與人類MG的發病過程及病理機制更為接近且實驗操作相對簡便，所以被多數實驗所采用，使用提純的電鰻電器官AChR蛋白為免疫原最為經典。然而電鰻在我國數量少且不易捕獲，且分離提純AChR蛋白的過程復雜，免疫原獲取困難限制了該方案的應用。1990年Zhang等[7]的研究發現以人工合成的電鰻AChR蛋白α亞單位肽段為免疫原可誘導大鼠建立EAMG模型。隨后Baggi等[4]的研究發現，與異種肽段相比，鼠源性肽段可更穩定、有效地建立大鼠EAMG模型。研究發現以R97-116為免疫原建模成功率最高，該方案近年來已被多項研究所采用[8]。以往文獻報道使用該方法成模率>70%，本項研究中成模率相對較低可能與樣本量較小有關。

T淋巴細胞的抗原決定簇為小分子多肽片段，肽段序列的線性排列順序決定T細胞識別的特異性[9]，這是人工合成肽段用于建立免疫相關模型的理論基礎[10]。但R97-116肽段作為AChR蛋白所包含的眾多免疫決定簇之一僅可被大鼠T淋巴細胞所識別，因此所產生的免疫應答較弱。H37Ra具有完整的抗原性，可充分激活巨噬細胞，同時顯著上調IL-12、TNF-α的表達；巨噬細胞吞噬H37Ra后經MHC分子途徑激活CD4+T淋巴細胞進而激活細胞免疫；而活化的CD4+T細胞所分泌的INF-γ則可進一步激活巨噬細胞[11]。H37Ra可通過誘導巨噬細胞和CD4+T相互作用而刺激和放大免疫反應[12]。如前文所述R97-116肽段免疫原性較弱，接種大鼠后可能難以刺激機體產生明顯的特異性免疫應答，這可能是對照組不能成功建模的原因。而實驗組中使用H37Ra后有效地激活了大鼠的免疫系統，使其對免疫原性較弱的肽段產生免疫應答，進而產生AChR抗體并建立EAMG模型。

筆者觀察到對照組中少量動物出現較輕微的無力癥狀，AChR抗體可疑陽性。這可能與本研究所使用的CFA有關，該試劑中含有少量H37Ra，但由于含量少，不能充分激活大鼠免疫系統，因此對照組僅有少量大鼠對R97-116產生免疫應答并出現輕微肌無力癥狀。僅使用R97-116和CFA并不能成功構建穩定、符合實驗標準的EAMG動物模型。

本研究提示H37Ra在以R97-116肽段為免疫原建立EAMG動物模型的實驗中有關鍵意義，在缺少H37Ra的情況下不能成功建模。H37Ra在該EAMG模型中的具體作用機制仍需從細胞學和分子生物學等多角度進一步研究。