hAOX 在人腎癌組織中的表達及其與臨床生物學行為的關系

高萬峰，于新路，李 青，張珊珊，宋 博，王 雪，蘇 宏

腎癌是泌尿系統第二位的惡性腫瘤，其發生發展的分子機制一直是研究的重點和難點。探尋更多參與腎癌發展的相關機制，進而挖掘有效治療方法是提高腎癌遠期療效的重要手段。人醛氧化酶(human aldehyde oxidase, hAOX)是鉬-黃素酶家族(molybdo-flavoenzyme family, MFF)中的一類蛋白，在肝、肺、小腸等組織中均有表達[1-3]，其活性水平己成為評價臨床用藥及治療效果的一項重要參數。近幾年來，越來越多的證據表明，hAOX與許多臨床疾病的病理生理學變化有關[4-5]。盡管hAOX的生理生化功能研究較多，但其在生理機制及發生作用等方面的信息還比較匱乏，國內關于hAOX在人腎腫瘤組織中的表達及意義還未見報道。本研究應用免疫組織化學法和Western印跡法檢測腎癌及癌旁腎組織中hAOX的表達，探討其與腎癌臨床生物學行為的關系及預后的重要意義。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2004-01至2012-12手術切除的腎癌標本86例，其中武警遼寧總隊醫院28例，沈陽軍區總醫院58例。男51例，女35例，年齡36～88歲，中位年齡62歲。所有病例均為初次手術，術前均未行介入、放化療等治療，所有術后標本均由高年資病理醫師參照第九版Arkman外科病理學[6]標準作出診斷，均證實為腎癌。其中透明細胞癌64例，乳頭狀腎細胞癌18例，顆粒細胞癌4例；參照2002年AJCC腎癌 TNM分期標準界定[7]，Ⅰ期26例、Ⅱ期31例，Ⅲ+Ⅳ期29例，腫瘤直徑≤2.5 cm者47例，>2.5 cm者39例。伴有淋巴結轉移31例，無淋巴結轉移55例。另取距離癌灶至少5 cm處正常腎組織20例作為對照。

1.2 試劑與方法 免疫組織化學Envision detection system試劑盒(兔/鼠雙標)購于上海鼎杰生物技術有限公司，hAOX兔抗人多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，工作濃度1∶100。即用型非生物素標本常規脫蠟，Envision法嚴格按試劑盒說明書操作。每次染色均以腎癌陽性切片作為陽性對照，PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定 免疫組化染色結果采用雙盲法判定。每張切片均由兩位高級職稱病理醫師獨立閱片，兩位診斷意見均為陽性方視為陽性。按照著色強度和陽性細胞率計算評分。其中不著色者記0分，淡黃色記1分，棕黃色者記2分，棕褐色記3分；陽性細胞百分率<5% 時記0分，5%～25%時記1分，26%～50%時記2分，51%～75%時記3分，76% ～100%時記4分。著色強度與陽性細胞百分率的得分相乘的積即為最終得分，≥6分者即判定為陽性，<6分者即判定為陰性。

1.4 統計學處理 采用Prism 6.0軟件進行數據統計處理，hAOX的表達率與患者各臨床因素之間的關系采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，檢驗水準α=0.05。生存分析采用K-M方法和Log-rank檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 hAOX在腎癌及癌旁組織中的表達 86例腎癌標本中，免疫組化hAOX的陽性表達率為22.09%(19/86)，陽性產物主要分布于胞核和胞漿，均顯示為黃色-棕褐色顆粒。癌旁組織中hAOX的陽性表達率達85.0%(17/20)，兩者表達率比較差異具有統計學意義(P<0.01)。

2.2 hAOX在腎癌組織中的表達與臨床病理特征的關系 免疫組化結果顯示，hAOX的表達與腎癌患者的年齡、性別、組織類型及腫瘤直徑均無關；但在淋巴結轉移、TNM分期及Ki-67表達方面有一定的相關性(分別為χ2=7.014，P=0.010；χ2=3.592,P=0.026；χ2=6.432，P=0.047)。見表1。

2.3 hAOX的表達與腎癌5年生存率的相關性分析 免疫組化結果顯示，在hAOX(+)表達的患者中，其5年生存率為51.72%，明顯高于hAOX(-)表達的患者組(7.02%)(χ2=5.736，P=0.018)。采用K-M法進行生存分析,結果顯示hAOX(+)表達的病例預后明顯優于hAOX(-)表達的病例(Log-rank檢驗，P=0.029)。

表1 hAOX的表達與腎癌臨床生物學行為關系分析 (n；%)

3 討 論

腎癌是全球范圍內較為常見的惡性腫瘤，其發病率逐年上升。據統計，我國每年新發腎癌病例數量已達到25萬，約30%的患者在診斷時已發生遠處轉移，嚴重影響生活質量和生存時間[8]。作為MFF中的一類蛋白，hAOX其分類號為 EC 1.2.3.1，通常是由2個相同亞基形成的同源二聚體構成，每個亞基具有2個[2Fe-2S]氧化還原中心、1個黃素輔因子(FAD)和1個底物結合域[9]。研究表明，醛氧化酶廣泛存在于生物體內，參與多種生理代謝。

Delpuech等[10]研究表明，hAOX可以將機體內形成的有毒醛類物質氧化為無毒酸，以緩解醛類物質對機體的毒害作用；可參與細胞內電子傳遞以及在代謝和繁殖等相關的生理活動中發揮重要作用。值得關注的是hAOX在多種腫瘤組織中的表達具有特異性。Neumeier等[11]發現，脂肪肝和高脂肪飲食會出現hAOX的高表達，脂聯素可通過過氧化物酶增殖物激活受體-α(PPAR-α)來下調hAOX的表達，進而避免由酒精及肥胖引起的脂肪肝。Shaw等[12]也證實hAOX產生的活性氧(ROS)與乙醇引起的肝臟毒性關系很大。李紅等[13]在蛋白水平檢測了肝癌細胞系、原發性肝癌及癌旁組織中的表達情況，發現hAOX 在癌旁組織中的表達明顯高于肝癌組織，Western印跡也證明這一結果，說明hAOX參與了肝臟癌變的發生和發展過程。Huang等[14]研究表明，hAOX在腸道腫瘤組織中的表達較正常組織低，且hAOX的表達與5年生存率呈正相關。

本研究首次從蛋白水平檢測了正常腎組織及腎癌組織中hAOX的表達。免疫組織化學檢測結果表明，86例腎癌標本中，免疫組化hAOX的陽性表達率為22.09%，陽性產物主要分布于胞核和胞漿。在正常組織中hAOX的陽性表達率達85.0%，明顯高于腎癌組織中的表達。另外，在腎癌組織hAOX 的表達與臨床病理特征的關系研究結果提示，hAOX的表達與腎癌患者的年齡、性別、組織類型及腫瘤直徑均無關；但與淋巴結轉移、TNM分期及Ki-67表達有明顯相關性。在hAOX(+)表達的患者中，其5年生存率明顯高于hAox(-)表達的患者組。且hAOX(+)表達的病例預后明顯優于hAOX(-)表達的病例。盡管hAOX與腫瘤發生、發展的相關性研究還較少，但基于以上結果，筆者認為hAOX 的表達可能維持了細胞的正常生長和分化表型，在腫瘤的發生及癌變轉化的過程中，其表達水平的降低促進了腎癌侵襲、浸潤和轉移的能力。最近研究發現，hAOX 表達水平降低致腫瘤轉移的機制很可能是通過參與維甲酸的合成實現相關基因的調控，由此誘發癌細胞發生上皮細胞間質轉化，進而促進腫瘤細胞發生轉移[15]。此外，Ki-67是腫瘤細胞增殖程度的有效指標，此研究表明，hAOX與Ki-67有可能通過競爭性調節作用促進腎癌的轉化和轉歸，其詳細分子機制尚需要進一步深入探討。

綜上所述，hAOX在腎癌組織中表達狀態與腎癌的發生發展密切相關，本研究雖無法對hAOX的低表達在腎癌中的作用機制做出明確定論，但是為腎癌發展過程中hAOX的進一步研究提供了一定依據和方向。