F血紅蛋白酸洗脫液溫度對Kleihauer-Betke實驗準確率的影響

朱宏遠，樊 斐，曹 正，陳可心，曾甲子，謝 鑫，楊麗珺

近些年來，一種較為少見的產科疾病——胎母輸血綜合征(fetomaternal emorrhage,FMH)逐漸被人們所重視。FMH是指一定量的胎兒血液通過破損的胎盤絨毛間隙進入母親體內血液循環，所引起的胎兒不同程度的失血及母親和胎兒溶血性輸血反應的臨床綜合征。因為其發病隱匿，臨床表現無特異性，不易做出早期診斷，常引起胎兒嚴重貧血、水腫，圍生兒病死率高[1-4]。Kleihauer-Betke(K-B)實驗是目前各醫院最常用的定量檢測母體血液循環中胎兒紅細胞數目的方法,可以確診并估計胎兒出血量，從而判斷胎兒失血的嚴重程度[5]。在臨床實驗過程中發現，酸性洗脫液的溫度是影響K-B實驗結果的關鍵因素之一，本研究通過比較研究，旨在確定合適的酸性洗脫液溫度。

1 對象與方法

1.1 對象 選擇2018-01至2018-04在北京婦產醫院就診的孕婦作為研究對象，以K-B實驗檢測結果≤0.1%的EDTA抗凝成人靜脈血為陰性對照組，EDTA抗凝臍帶血為陽性對照組。取同血型的臍帶血和未孕女性靜脈血定量混合作為檢測樣本，配制成臍帶血百分比含量為0.5%、1%、3%、5%、10%的5個水平的實驗組檢測樣本。已發生明顯溶血的標本和K-B實驗檢測結果>0.1%的靜脈血標本不宜用作檢測樣本的制作。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器 Olympus DP26光學顯微鏡；胎兒紅細胞計數軟件系統(北京穗加)。

1.2.2 試劑 80%乙醇(分析純)、95%乙醇(分析純)、蘇木精(分析純)、25%鹽酸(分析純)、氯化高鐵(分析純)、1%伊紅溶液均購自北京化工廠。pH(1.65±0.1)酸性洗脫液配置：由洗脫液A液與洗脫液B液按照5∶1混勻。洗脫液A液配置：蘇木精0.75 g溶于95%乙醇100 ml混勻；洗脫液B液配置：氯化高鐵2.4 g溶于25%鹽酸2 ml，混勻后，加入蒸餾水至100 ml。

1.3 方法

1.3.1 血涂片的制備 實驗組和對照組的血液均以抗凝靜脈血(1.5～2.2 mg/ml EDTA-K2 抗凝)作為血液來源，按照常規方法推制血涂片。

1.3.2 K-B實驗檢測血紅蛋白F (1)將血涂片自然干燥10 min，再用80%乙醇固定5 min，水洗待干；(2)配置酸性洗脫液；(3)將酸洗脫液均勻滴在固定好的血膜上，保溫洗脫1 min后，水洗待干；(4)用1%伊紅染液染1 min，水洗待干后鏡檢，在油鏡下，含有胎兒紅細胞的血紅蛋白(HaemoglobinF，HbF)的紅細胞被伊紅染液染成鮮紅色為陽性細胞，僅留下淡影的細胞膜者為陰性紅細胞；(5)利用北京穗加軟件有限公司開發的胎兒紅細胞計數軟件系統，進行計數1000個以上紅細胞中胎兒陽性紅細胞所占百分率，作為胎兒紅細胞染色結果。根據《全國臨床檢驗操作規程》(第三版)，成人血紅蛋白F酸洗脫染色結果應小于1%，故將HbF水平小于1%為陰性結果，HbF水平大于1%為陽性結果[6]。

1.3.3 不同洗脫液溫度的比較 分別制作臍帶血含量為0.5%、1%、3%、5%、10%的5個標準水平的混合血液為檢測樣本，每一個水平的檢測樣本混合均勻后制作8張血涂片，均分用于兩個組。將1.3.2步驟(3)中洗脫環節溫度分別定于37 ℃和45 ℃，分別進行K-B實驗染色，最后分析實驗結果確定最適的洗脫溫度。

1.4 統計學處理 采用SPSS21.0統計學軟件進行統計學分析，兩組樣本分別進行單組樣本均數的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 穗加胎兒紅細胞計數軟件系統與常規光學顯微鏡下的效果比較 圖1所示，穗加胎兒紅細胞計數軟件識別每一個空泡樣陰性母血紅細胞，并標注為藍色；識別紅色濃染的陽性胎兒紅細胞，標注為紅色；計數1000個以上紅細胞中胎兒陽性紅細胞所占百分率。與光學顯微鏡相比,穗加胎兒紅細胞計數軟件不僅具有簡便快速的優勢，還彌補了光學顯微鏡下計數準確率低、結果偏差大等諸多缺點，故本研究使用該軟件進行計數。

圖1 胎兒紅細胞計數兩種方法效果比較

2.2 洗脫溫度染色結果比較 如圖2A所示，洗脫溫度37 ℃時，成人紅細胞也被伊紅染成了淺粉色，沒有形成無色透明空泡樣，與含有HbF的胎兒紅細胞未形成鮮明對比；洗脫溫度為45 ℃時，成人紅細胞呈現無色透明空泡樣，與被伊紅染成淺粉色的含有HbF的胎兒紅細胞形成鮮明對比(圖2B)。

圖2 胎兒紅細胞不同洗脫溫度染色結果比較

2.3 不同溫度下K-B實驗結果的比較 按照1.3.3進行實驗，結果如表1所示，當樣本為陰性標本時(<1%)，洗脫溫度無論是37 ℃還是45 ℃，K-B法檢測結果與標準值之間的差異均無統計學意義；當標本為陽性標本時(≥1%)，洗脫溫度定為37 ℃的檢測結果與標準值之間的差異有統計學意義(P<0.05)，而45 ℃的檢測結果與標準值之間的差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 胎兒紅細胞不同洗脫溫度染色結果 (%)

3 討 論

目前，穗加胎兒紅細胞計數軟件是國內唯一的一款全自動胎兒紅細胞計數系統，依據圖像色差原理專為F血紅蛋白酸洗脫實驗所創。實驗室定量檢測母血中胎兒紅細胞是確診FMH的直接依據，而K-B法是目前應用最廣泛的實驗室定量檢測母血中胎兒紅細胞的方法[7，8]。K-B實驗，又稱為酸洗脫實驗，其原理為：胎兒紅細胞和成人紅細胞所含血紅蛋白種類不同，胎兒紅細胞的血紅蛋白為HbF，而成人紅細胞的血紅蛋白為HbA。HbF的抗酸能力強，置酸性洗脫液中一定時間只有含HbF的紅細胞不被洗脫，被伊紅染色為粉紅色。通過計數粉紅色細胞占全部紅細胞的比例以確定胎兒紅細胞的比例。但實際工作中K-B實驗操作不規范，脫色時間短時，容易將不含HbF細胞錯誤地計入胎兒紅細胞，影響實驗結果的準確性。因此，有一個實驗效果優良、結果準確可信的K-B實驗方法十分重要[9，10]。

在臨床實驗工作中我們發現洗脫液的溫度對實驗結果有一定的影響，基于此思路，本研究分別在洗脫液溫度37 ℃和45 ℃下進行實驗，本研究結果可以說明洗脫溫度定為45 ℃相比于37 ℃可產生更好的洗脫效果，胎兒紅細胞與成人紅細胞區分明顯，計數結果也更加準確，可以有效解決洗脫效果不好、易給實驗人員造成視覺干擾等問題。當檢測樣本為陰性標本時，洗脫溫度無論是37 ℃還是45 ℃，檢測結果與標準值之間的差異均無統計學意義；當檢測標本為陽性標本時，洗脫溫度定為37 ℃的檢測結果與標準值之間的差異有統計學意義，而45 ℃的檢測結果與標準值之間的差異無統計學意義。綜上所述，將穗加胎兒紅細胞計數軟件與F-蛋白酸洗脫實驗45 ℃水浴相結合，大大提高了實驗的效率、陽性檢出率及準確率等，為FMH的診治和預后判斷提供了良好的實驗室數據支持。

目前K-B法應用廣泛，具有使用儀器少、方便快捷、適合急診夜班使用的優點[11]，而其缺點是對實驗者操作要求較高、容易受到溫度等外在因素的干擾、大量的細胞計數易導致實驗者視覺疲勞、缺乏有效的質量控制體系等，并且有研究發現，K-B法導致的假陽性率較高且重現性低[12]。