高強度間歇運動加重潰瘍性結腸炎小鼠炎性反應的影響

黃 凱，王大寧，彭 朋，秦永生，李學恒

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是特發于結腸的慢性非特異性炎性反應，屬消化系統常見病，其病程較長且易復發，可使患者生活質量明顯下降。UC在歐美國家較為常見，近年來在我國的發病率也呈持續上升趨勢，目前臨床上尚無根治UC的藥物和方法，且易復發。因此，探索作用持久且不良反應小的藥物及非藥物治療手段與有效的預防策略勢在必行[1]。目前已證實，運動是防治多種慢性病(肥胖、糖尿病、高血壓等)的重要手段，同時也是臨床治療的有益補充。前期的研究發現，中低強度持續有氧運動(continuous aerobic training，CAT)可減輕緩解期UC患者及UC小鼠的臨床癥狀并降低炎性反應[2，3]。高強度間歇運動(high-intensity interval training，HIIT)是近年來新興的一種運動模式，與傳統CAT相比，具有省時有效等特點。Ploeger等[4]以克羅恩病(與UC同屬炎性反應性腸病)患者為受試對象，結果發現，HIIT并未顯著上調血漿炎性反應因子水平，且患者并無不良反應，初步證實了HIIT的安全性，然而長期HIIT對UC的作用尚未明確。本研究旨在探討8周HIIT預適應對葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導C57BL/6小鼠實驗性UC臨床癥狀和炎性反應的影響，為制定針對UC的最佳運動處方提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 45只8周齡雄性C57BL/6小鼠，體重18～20 g，購自軍事醫學科學院實驗動物中心。分籠飼養(5只/籠)，自由進食水。實驗動物適應1周后將其隨機分為3組，安靜對照組(rest control，RC)、安靜造模組(rest model，RM)和運動造模組(exercise model，EM)，每組15只。

1.2 干預方法 RC組安靜飼養8周后自由飲用蒸餾水7 d；RM組安靜飼養8周后自由飲用3.5% DSS溶液(w/v)7 d進行UC造模；EM組進行8周HIIT后行UC造模(造模方法同RM組)。EM組運動預適應方案為：先進行5 min跑臺熱身運動(10 m/min)，之后以15～28 m/min速度運動4 min(8周內跑速逐漸增加)、間歇2 min為1個循環，共完成10個循環，5周/次，共8周。

1.3 觀察與評分 (1)疾病活動指數(disease activity index，DAI)評分：每天記錄動物體重、大便性狀和便血情況(臨床癥狀)，按參照文獻[5]將上述三個方面的評分相加后取平均數作為DAI。(2)動物取材：末次實驗結束后48 h麻醉動物，灌腸，取盲腸遠端至肛門部分結腸組織，測量其長度。隨后沿腸系膜剪開腸腔，生理鹽水沖洗后留取遠端結腸，將組織分為兩部分，一部分制作病理組織切片，另一部分用錫紙包裹投入液氮中并迅速轉入-80 ℃低溫冰箱凍存，待測炎性反應因子基因表達。(3)結腸組織病理學觀察與評分：取結腸組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋，5 μm切片后行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，中性樹膠封固。于光學顯微鏡下進行組織病理學觀察(結構破壞、隱窩丟失狀況、炎性浸潤等)并參照文獻[5]進行組織病理學評分。(4)結腸炎性反應因子mRNA表達量：利用電動勻漿器將結腸組織勻漿后，使用Trizol試劑盒提取組織總RNA，反轉錄反應獲得cDNA，實時熒光定量PCR儀(9600，美國PE)測定結腸炎性反應因子-白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα，TNF-α)mRNA表達量，以β-actin作為內參基因，各組mRNA相對表達量以RC組的倍數表示。

2 結 果

2.1 樣本量分析 造模期間，EM組拒跑1只，死亡2只，RM組死亡1只，最終樣本量為41只，各組分別為：RC組15只，RM組14只，EM組12只。

2.2 各組體重和DAI評分的變化 體重：造模期間，RC組體重無顯著性變化(P>0.05)，RM和EM組體重從第5 天開始下降并持續至第7天，差異有統計學意義(P<0.05)，EM組體重在第6天和第7天均低于RM組(P<0.05，圖1)。DAI評分：造模期間，RC組DAI評分均為0，第3天開始，RM和EM組DAI評分開始升高并持續至第7 天，差異有統計學意義(P<0.05)，EM組DAI評分在第5～7 天高于RM組，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

圖1 3組小鼠造模期體重的變化

與RC組比較，①P<0.05；與RM組比較，②P<0.05

2.3 結腸長度及組織病理學觀察 (1)結腸長度：與RC組[(8.2±1.5)cm]比較，RM組[(7.1±1.3)cm]和EM組[(5.7±1.6)cm]結腸長度縮短, 差異有統計學意義(P<0.05)；EM組結腸長度低于RM組, 差異有統計學意義(P<0.05)。(2)結腸組織病理學觀察與組織病理學評分：RC組細胞排列整齊、結構完整、腺體豐富, 無杯狀細胞缺失及炎性細胞浸潤；RM組小鼠腸黏膜水腫、細胞排列紊亂、炎性反應細胞浸潤、杯狀細胞缺失、潰瘍形成，組織病理學評分為(2.8±0.6)高于RC組的(0.3±0.1)，差異有統計學意義(P<0.05)；EM組較RM損傷程度加重，組織病理學評分(3.6±1.0)高于RM和RC組, 差異有統計學意義(P<0.05,圖3)。

圖2 各組DAI評分的變化

與RC組比較，①P<0.05；與RM組比較，②P<0.05

圖3 結腸病理組織HE染色(×200)

2.4 結腸炎性反應因子表達的變化 與RC組比較，RM和EM各組炎性反應因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)mRNA表達量升高(P<0.05)；與RM組比較，EM組IL-1β和TNF-α mRNA表達量進一步上調，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 各組結腸炎性反應因子mRNA表達水平

注：與RC組比較，①P<0.05；與RM組比較，②P<0.05

3 討 論

研究發現，規律運動具有抗炎效應，能夠對炎性反應相關疾病(如肥胖、動脈粥樣硬化、哮喘等)產生治療或預防作用，然而關于體力活動與UC的關系至今尚無定論。橫斷面調查發現，久坐少動生活方式是UC的重要危險因素[6]，但隊列研究的結果卻相反。針對緩解期UC患者的臨床研究發現，傳統CAT能夠緩解患者癥狀或無明顯作用[2, 6，7]，因此針對UC患者特異性運動處方(運動方式、運動強度、運動時間及運動頻率等)仍未確定。

動物實驗一般采用運動預適應方案，其機制在于反復運動刺激誘導機體產生適應性變化，機體對于隨后的不良應激源(生物、物理、化學、心理、社會等)耐受性增強。前期的研究證實，隨意轉輪運動[3, 8](屬CAT模式)可改善實驗性UC模型炎性反應與臨床癥狀。HIIT作為一種省時有效的運動模式，與CAT相比，其對心肺和代謝系統的影響相似，對骨骼肌的作用更佳，然而HIIT與腸道的關系鮮有關注。我們推測，HIIT理應對UC產生有益效應。本研究以C57BL/6小鼠為實驗動物，以DSS為誘導劑成功制作UC模型(即與RC組比較，RM組小鼠結腸長度縮短，DAI、組織病理學評分及炎性反應因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達量升高)，以跑臺HIIT為運動模式，結果發現，與RM組比較，EM組結腸長度縮短，DAI、組織病理學評分及炎性反應因子IL-1β和TNF-α mRNA含量進一步上調，提示8周HIIT預適應加重UC臨床癥狀與炎性反應。

Cook等[9]同樣以DSS誘導小鼠UC為模型證實，隨意轉輪運動減輕而持續跑臺運動則加重結腸炎病情。他們認為，跑臺運動屬于被動運動，可造成實驗動物心理應激。Reber等[10]發現，小鼠接受擁擠應激后再飲用DSS溶液進行UC造模，使結腸炎的癥狀進一步加重。由此推測，跑臺運動方式造成動物慢性心理應激是本研究中EM組UC癥狀加重的原因之一。然而Bilski等[11]研究發現，持續跑臺運動可減輕三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS)誘導的大鼠UC臨床癥狀并下調炎性反應因子表達水平。研究結果存在差異可能與動物種屬及造模方式(DSS vs. TNBS)等因素有關。

劇烈運動或力竭運動可誘導機體產生暫時性炎性反應并伴隨細胞因子含量上調，這一效應與運動強度和運動時間呈劑量-反應關系，因此運動療法的健康效應具有運動負荷(運動強度×運動時間)依賴性，長時間高強度劇烈運動可導致胃腸功能紊亂，而中等強度則產生保護效應。針對緩解期UC患者的研究顯示，12周HIIT和CAT均可改善患者運動能力和生活質量，但以HIIT的作用更佳[12，13]，但該研究并未測定炎性反應因子水平。本研究中運動強度、持續時間、完成組數及運動頻率均明顯優于張艷等[13]的研究，因此運動強度過高、持續時間過長造成的運動負荷過重是UC小鼠病情惡化的另一原因。Moraska等[14]發現，8周高強度跑臺運動造成健康大鼠腎上腺肥大和胸腺萎縮，提示高強度運動誘導身體應激反應，與上述提及的心理應激共同作用于機體，導致免疫-內分泌系統功能紊亂，進而引起UC小鼠炎性反應加重。

此外，與其他組織器官不同，腸道內存在多種微生物并外界相通，其特殊的解剖結構決定易受應激性損傷[15]，人類腸易激綜合征也證實了這一點。研究發現，腸道微生物多樣性下降是UC的重要發病機制[16]。橫斷面研究證實，規律有氧運動能夠增加腸道微生物多樣性，進而對多種炎性反應性疾病具有預防及治療作用[17]。Allen等[18]指出，不同運動方式對腸道菌群的調控存在顯著差異。隨后的研究進一步證實，UC小鼠被動運動(跑臺)通過上調腸道上皮細胞趨化因子配體表達而促進細菌微生物從腸腔面向黏膜層轉移，同時對巨噬細胞產生趨化效應，進而誘導炎性反應[9]。因此推測本研究中跑臺HIIT造成的腸道菌群失衡可能也是UC癥狀惡化的原因之一。

總之，長期HIIT預適應加重DSS誘導UC小鼠臨床癥狀和炎性反應，因此HIIT的健康效應及安全性尚需更多實驗證實。