miR-383調控血管生成因子VEGFA的表達并抑制血管生成

徐 燕，黃建航，鄭志平，洪小川，何 艷

血管生成是指源于已存在的毛細血管發育而形成新血管的過程，其在許多生理和病理過程中起到至關重要的作用[1]。正常生理條件下，如胎兒的生長發育、傷口愈合、女性經期等，血管生成在其中扮演重要的角色[2]。但血管生成異常則涉及到多種疾病[3]，如與血管生成過度相關的疾病包括癌癥、動脈硬化、關節炎及一些感染性疾病等[4-6]；與血管生成不足相關的疾病包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、外周動脈疾病、腦卒中等。血管生成是一個涉及多種血管生成因子調節的復雜過程，需要相關信號因子激活或抑制的動態平衡進行精細的調控[7]。其中，血管生成因子[特別是血管內皮生成因子(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)]的表達調控紊亂是血管生成異常的分子基礎。因此,深入研究血管生成因子的表達調控有著重要意義。

微核糖核酸(microRNA,miRNA)是一類大小約為22個核苷酸、高度保守的內源性非編碼小分子RNA[8]。miRNA可通過調控其靶標基因的表達[9-10]，參與有機體多種生理和病理過程[11]。文獻報道，miR-383在多種腫瘤組織或細胞中表達下調[12-16]，且以腫瘤抑制因子的身份影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移，從而在腫瘤的發生、發展過程發揮作用[17]。而血管生成對于腫瘤的生長和轉移是必不可少的。本研究擬探討miR-383與血管生成的關系，為腫瘤的抗血管治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 HEK 293T細胞株和人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)購自武漢中國典型培養物保藏中心。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,批號：P160707ES，德國PAN-Biotech公司)；DMEM培養基(批號：AD16191267，美國Hyclone公司)；TransIntroTMEL Transfection Reagent試劑(貨號：FT201-01，北京全式金生物技術有限公司)；人類成熟的miR-383模擬物(hsa-miR-383 mimic)及陰性對照物(control mimic)(廣州銳博生物科技公司)；Nano-Glo?Dual-Luciferase?報告基因檢測系統(貨號：N1620，美國Promega公司)；VEGFA抗體(貨號：26157-1-AP，武漢三鷹生物技術有限公司)和β-actin抗體(貨號：66009-1-Ig，武漢三鷹生物技術有限公司)。VEGFA的酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(貨號：E-EL-H0111c，中國Elabscience公司)；基質膠(GeltrexTM LDEV-Free reduced growth factor basement membrane matrix,貨號：A1413201，美國BD公司)。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析 使用在線預測工具miRWalk 2.0 (http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/，集合了DIANAmT，miRanda,miRwalk，PITA和Targetsan等miRNA靶標預測軟件)對人源的miR-383的靶基因進行預測。

1.2.2報告載體的構建 以人的基因組DNA為模板擴增出候選基因VEGFA的3′-非翻譯區(3′-untranslational region，3′-UTR)片段，連入pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector(貨號：E1330，美國Promega公司)，此為野生型熒光素酶報告基因載體即PGLO-VEGFA-WT，經測序驗證后用于細胞轉染。同時采用PCR定點誘變技術將miR-383的結合區域關鍵堿基改變，連入pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Expression Vector，此為突變型熒光素酶報告基因載體，即PGLO-VEGFA-MUT，經測序驗證后也用于細胞轉染。

1.2.3細胞培養及基因轉染 HEK 293T細胞和HUVEC細胞所用培養基為DMEM培養基(含10%的FBS)，置于37 ℃、體積分數為0.05的CO2細胞培養箱中培養。細胞分板后，質粒及miRNA mimic使用TransIntroTMEL Transfection Reagent轉染。

1.2.4熒光素酶報告基因活性分析 分別提取野生型和突變型報告基因質粒，將二者分別與miR-383 mimics或者control mimics共轉染HEK 293T細胞，48 h后收集細胞，使用雙熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶的活性。

1.2.5實時熒光定量PCR 分別設計靶基因VEGFA和內參基因actin的定量引物，序列如下：

VEGFA-F：5′-GAGCTTCCTACAGCACAAC-3′

VEGFA-R：5′-GCAGGAACATTTACACGTCTG-3′

actin-F：5’-CATCGTCCACCGCAAATG-3′

actin-R：5′-CACCTTCACCGTTCCAGTT-3′

使用SYBRGreenⅠ(貨號：04913850001，美國Roche公司)的qPCR法檢測基因表達。產物用熱熔解曲線和凝膠電泳兩種方式檢測核準，基因表達水平計算采用2-ΔΔCt法。

1.2.6ELISA和Western-blot檢測分泌型和細胞內的VEGFA蛋白的表達 6孔板中的HUVEC細胞分別轉染miR-383 mimic或control mimic培養36 h后，去除原有培養基，更換為無血清的DMEM培養基，放回培養箱繼續培養。12 h后，收集細胞培養上清，4 ℃、1 000 r/min，離心20 min，即得到分泌型的VEGFA，采用ELISA進行濃度測定。收集細胞，用預冷的PBS洗3次后，將細胞置于冰上，加入200 μL的1.0×lysis buffer裂解30 min，離心后棄沉淀留上清(即細胞內的VEGFA)，加50 μL 5×SDS-PAGE loading buffer煮沸10 min，稍離心后進行Western-blot檢測。

1.2.7體外血管生成實驗 HUVEC細胞接種于12孔板，分別轉染miR-383或者control mimics后置于DMEM(含10% FBS)培養基中培養36 h。去除原有培養基，更換為無血清的DMEM繼續培養12 h后，收集細胞培養上清，HUVEC細胞分泌的細胞因子VEGFA便存在于此上清中，12 000 r/min，離心5 min，用于后續血管生成試驗。在96孔培養板中，每孔加入70 μL BD matrigel基質膠，置于37 ℃細胞培養箱中凝固30 min。將上述轉染miR-383或者control mimics的HUVEC細胞消化下來，按每孔細胞濃度0.8×105mL-1接種于BD matrigel基質膠上，并加入相應的100 μL上述細胞培養液上清作為HUVEC的培養液，置于細胞培養箱中培養12 h，在倒置顯微鏡下觀察管狀結構形成情況并統計數量。

2 結 果

2.1 生物信息學分析揭示miR-383可靶向調節VEGFA 基于不同算法的microRNA-gene target分析軟件(DIANAmT，miRanda，miRwalk，PITA和Targetsan)預測結果顯示，在眾多可能的靶基因中有許多與血管生成相關的基因，包括VEGFA、成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor,FGF)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)等。其中，與血管生成密切相關的VEGFA，FGF9，FGF17及FGF19在5種算法中都被預測為miR-383的靶基因，即這些靶基因的3′-UTR存在miR-383潛在的結合位點，能夠靶向調控其表達(表1)。本研究首先選擇目前研究最為廣泛和成熟的VEGFA作為候選基因進行下一步實驗研究。

2.2熒光素酶報告基因活性分析實驗證實miR-383對VEGFA的靶向調控 為進一步驗證miR-383是否靶向調節VEGFA，本研究構建了VEGFA基因3′-UTR的雙熒光素酶報告基因質粒pGLO-VEGFA-WT和突變型的VEGFA 3′-UTR報告基因質粒(不含miR-383結合位點)pGLO-VEGFA-MUT(圖1A,B)。將miR-383 mimic或control mimic和VEGFA的3′-UTR報告基因質粒共轉染HEK 293T細胞，培養48 h后收取細胞進行雙熒光素酶活性分析。結果顯示，共轉染pGLO-VEGFA-WT的miR-383組的熒光素酶活性較control組明顯下降(P<0.05，圖1C)；而共轉染pGLO-VEGFA-MUT的miR-383組與control組的熒光素酶活性無差別(P>0.05，圖1C)。雙熒光素酶報告基因活性實驗結果表明，miR-383可通過直接結合VEGFA基因3′-UTR上的靶序列而抑制VEGFA基因的表達。

表1 生物信息學預測miR-383的靶基因Tab 1 The target gene of miR-383 through bioinformatics prediction

A：miR-383在VEGFA 3’-UTR的結合位點；B：構建雙熒光素酶報告基因質粒pGLO-VEGFA-WT和突變型的pGLO-VEGFA-MUT(不含miR-383結合位點)；C：熒光素酶活性檢測(與control mimics組比較，△：P<0.05).圖1 熒光素酶報告基因活性分析實驗證實miR-383通過結合VEGFA的3’-UTR 而抑制其表達Fig 1 The luciferase assay confirmed that miR-383 could inhibit VEGFA expression by binding to the its 3’-UTR

2.3miR-383對VEGFA mRNA和蛋白表達水平的影響 雙熒光素酶報告基因活性分析實驗顯示，miR-383靶向抑制VEGFA的表達。為進一步揭示miR-383對VEGFA的調控及分子機制，本研究分別從mRNA水平和蛋白水平檢測miR-383對VEGFA表達水平的影響。首先qPCR技術檢測miR-383對VEGFA的mRNA水平的影響發現，過表達miR-383(圖2A)對VEGFA的mRNA水平無影響(P=0.99，圖2B)。ELISA和Western-blot分別檢測細胞分泌的VEGFA和細胞內的VEGFA結果顯示，轉染miR-383不僅導致分泌的VEGFA減少(P<0.05，圖2C)，同時細胞內的VEGFA也顯著減少(圖2D)。

2.4miR-383介導的VEGFA的表達抑制對血管生成能力的影響 將HUVEC細胞接種于BD matrigel基質膠上，并分別加入轉染miR-383或者control mimics的細胞培養液上清，對HUVEC細胞進行誘導培養。12 h后在倒置顯微鏡下觀察管狀結構形成情況并統計數量。結果顯示，miR-383過表達組較對照組HUVEC形成管狀結構數量顯著減少(P<0.01，圖3)。

3 討 論

人類基因組DNA絕大多數的轉錄產物為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)，即不編碼蛋白質但具有重要生物學功能的RNA分子。microRNA是目前研究最為廣泛的一類非編碼RNA，能夠通過調控其靶基因的表達，參與多種生理和病理過程。microRNAs調節基因表達的機制主要有兩種方式，一種是引起靶基因mRNA降解，從而在mRNA和蛋白水平同時下調基因表達[8]；一種是通過影響翻譯效率只在蛋白水平下調基因表達[9]。本課題組前期利用生物信息學方法對miR-383潛在的靶基因進行預測。結果發現，在眾多可能的靶基因中有許多與血管生成相關的基因，包括VEGFA，FGF，MMP等，這提示miR-383可能在血管生成過程中發揮著重要的作用。進一步利用雙熒光素酶報告基因檢測系統、qPCR及Western-blot實驗發現，miR-383可以靶向調控血管生成因子VEGFA的表達,且調控機制是通過影響翻譯效率，只在蛋白水平下調VEGFA的表達。體外血管生成實驗是一種有效的評價促血管生成能力的方法[18]。通過體外血管生成實驗也表明，miR-383所介導的VEGFA表達下調可顯著削弱血管生成能力。因此，miR-383能夠通過調控VEGFA的表達影響血管生成。

A,B：qPCR檢測過表達miR-383對VEGFA的mRNA水平的影響;C：利用ELISA檢測過表達miR-383對分泌到胞外的VEGFA蛋白的影響(與control mimics組比較，△：P<0.05);D：利用Western-blot檢測過表達miR-383對胞內的VEGFA蛋白的影響.圖2 過表達miR-383對細胞內源VEGFA mRNA和蛋白水平的影響Fig 2 Effects of overexpression of miR-383 on expression of endogenous AGGF1 at mRNA and protein levels

HUVEC：人臍靜脈內皮細胞.A:轉染control mimics對血管生成的影響；B：轉染miR-383對血管生成的影響；C：A，B中的管腔形成數量(與control mimics組比較，△：P<0.05).圖3 miR-383對HUVEC血管生成能力的影響Fig 3 Effects of miR-383 on the angiogenic potential of HUVEC cells

已有研究表明，miR-383與許多腫瘤的發生、發展密切相關，且主要是通過影響腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等發揮作用。miR-383能夠通過下調PARP2[poly(ADP-ribosyl)transferase-like 2]蛋白的表達從而抑制宮頸癌的發展[15]。在肝細胞肝癌中，miR-383的表達明顯減少，且通過調控LDHA(lactate dehydrogenase A)的表達影響肝癌細胞的增殖、侵襲和糖酵解，從而發揮腫瘤抑制因子的作用[16,19]。眾所周知，腫瘤生長依賴于血管生成[20]。腫瘤細胞能夠分泌多種生長因子、胞外基質的各種組分及一些相關的酶類，參與血管生成過程；而新生的血管又是腫瘤細胞賴以生長、侵襲和轉移的基礎。miR-383能夠抑制血管生成因子VEGFA的表達，進而影響血管生成，這一結果可能揭示miR-383影響腫瘤發生、發展的新機制，即miR-383通過影響腫瘤的血管生成過程從而在腫瘤的發生、發展過程中發揮著重要的作用。該假設有待于進一步實驗證實。

血管生成過程受到促血管生成因子和血管生成抑制因子的精確調控[21-22]。已發現的血管生成因子種類很多，其中，VEGFA是研究最為廣泛和成熟的一個促血管生成因子，并作為臨床上促血管生成藥物或抗血管生成治療靶點在缺血性疾病和癌癥中應用。miR-383能夠抑制血管生成因子VEGFA的表達，進而影響血管生成，為臨床上以VEGFA作為治療靶點提供實驗基礎和理論依據。